SILICIANO: caratterizzazione del reservoir, studi sulla cura

[uffa2]

non ho capito: vuol dire che è possibile "addestrare" i CD8 a riconoscere e ammazzare i CD4 latentemente infetti?

[Dora]

non ho capito: vuol dire che è possibile "addestrare" i CD8 a riconoscere e ammazzare i CD4 latentemente infetti?

Ehhh ... corri troppo! Certo, sarebbe bello. Ma l'idea di Siliciano è più modesta: i CD8, in buona parte perché indeboliti dal virus, non riescono a fare il loro dovere, cioè a montare delle reazioni citolitiche nei confronti delle cellule infette. Quindi, quand'anche riuscissimo a risvegliare il virus dalla latenza senza scatenare una tempesta di citochine a causa dell'attivazione generalizzata di tutti i T, ci troveremmo con dei CD4 attivati (non più quiescenti) e produttivamente (non più latentemente) infetti, che non muoiono (l'ha dimostrato Bob l'anno scorso) e se ne vanno in giro, magari ad infettare altre cellule. Allora dobbiamo trovare il modo (e ora lui ha dimostrato che almeno un modo c'è), magari attraverso un qualche "vaccino", per rinforzare i CD8, renderli più cattivi e aiutarli ad uccidere 'ste mine vaganti che portano in sé virus risvegliato.

[uffa2]

ah ecco, volevo "ben" dire

[Dora]

ah ecco, volevo "ben" dire

Sì, lo so che ogni volta che Siliciano parla verrebbe voglia di tapparsi le orecchie, mettendosi ad urlare.
Comunque sia, quel suo lavoro dell'anno scorso, per quanto sia duro da digerire, sta facendo scuola e ormai nessuno che si occupi di eradicazione può prescinderne, perché ha minato la credenza (metafisica) che basti riattivare il virus del reservoir perché i CD4 non più quiescenti schiattino per grazia divina. Ormai sanno che non c'è scampo: se riesci a svegliare il virus dalla latenza, devi anche avere un modo per rinforzare le reazioni CTL. Altrimenti, è fatica sprecata.
Grazie, Bob, che ce l'hai insegnato.

E la sua lezione la stiamo vedendo in ogni articolo sull'eradicazione uscito nell'ultimo anno. E anche al CROI nessuno ha potuto esimersi dal riconoscerlo.
Uno per tutti, di cui non sto a raccontare la storia nei dettagli ma di cui posto solo l'abstract e qualche slide, Thomas Norton (che vuol dire Nathaniel Landau), New York University School of Medicine, che sta lavorando sulle cellule dendritiche. [La prima slide è TUTTO Siliciano, quindi sarebbe da segnare di rosso OGNI punto]


Dendritic Cells Transduced with Vpx-packaged LV Vector Encoding CD40L Enhance Cytotoxic T Cell Responses and Disrupt HIV-1 Latency - #125

Background: Dendritic cells (DC) are prime targets for immunotherapies but are not readily infected by lentiviral vectors due to a post-entry restriction mediated by SAMHD1. This restriction can be overcome by packaging the SIV vpx accessory protein into lentiviral virions. We used this principle to generate a system in which vpx-containing lentiviral vectors express an immunostimulatory protein and a peptide epitope to enhance DC function and elicit antigen-specific immune responses. We previously showed that our vectors achieve efficient DC transduction while enhancing DC maturation and secretion of Th1-skewing cytokines. We now investigate the ability of these vectors to expand cytotoxic T cells and awaken latent HIV-1 proviruses to simulate a “shock and kill” approach for eradication of the latent HIV reservoir.

Methods: Lentiviral vectors were designed that packaged vpx and expressed CD40L and a peptide epitope from flu. DC transduction was quantified by FACS. Expansion of memory responses was evaluated following transduced DC co-culture with a flu-specific CD8+ T cell clone and autologous CD8+ T cells. Transduced DC were co-cultured with ACH-2 cells, a model latently infected cell-line, to determine whether quiescent provirus expression was activated.

Results: Rate of DC infection with vpx-packaged viruses was 60-fold higher than control viruses. Only DCs transduced with vpx-packaged vectors encoding flu induced significant interferon-γ (IFN-γ) from the T cell clone when compared to controls. This IFN-γ production was enhanced 4-fold further when vpx-packaged vectors encoded CD40L. DC transduced with vpx-packaged lentiviral vectors encoding CD40L and flu robustly expanded antigen-specific CD8+ cytotoxic T cell responses as evidenced by flu-tetramer staining and ICS for IFN-γ compared with non-vpx vectors. DC transduced with Vpx-packaged lentiviral vectors encoding CD40L induced quiescent provirus in ACH-2 cells 5-fold better than controls when supernatants were evaluated via TZM-bl assay.

Conclusions: Capitalizing on the ability of our lentiviral vector system to achieve efficient DC transduction, maturation, and secretion of Th1-skewing cytokines, we show that our system can effectively stimulate antigen-specific cytotoxic T cell responses. The transduced DC also activate HIV transcription and virus production from latently infected cells. We conclude that this approach has promise for activating the latent HIV reservoir and inducing an antigen-specific CTL response capable of eliminating the latent reservoir.

[Dora]

REAZIONI CTL - Riprendo per brevità la solita sintesi del lavoro di Siliciano-Shan:

Negli stessi giorni in cui Siliciano e il suo team presentavano al CROI la loro ricerca sull’utilità di stimolare reazioni citolitiche da parte dei linfociti T al fine di meglio eliminare le cellule in cui il virus è stato risvegliato dalla latenza, veniva pubblicato su Immunity l’articolo relativo a questo studio.
In buona parte ne ho già parlato dando conto dell’abstract e della relazione di Liang Shan, però credo che raccontare parti dell’articolo aiuti a capire meglio l’importanza di questa ricerca e dei suoi possibili sviluppi, anche perché pare riportare tutto il peso della reazione dell'ospite sull'immunità cellulare a scapito della reazione anticorpale (alla faccia dei vari Super-Anticorponi-Neutralizzanti, che un mese sì e uno no vengono spacciati come LA soluzione del problema).
(...)

Stimulation of HIV-1-Specific Cytolytic T Lymphocytes Facilitates Elimination of Latent Viral Reservoir after Virus Reactivation

(...)In questo studio, Siliciano ha

• 1. generato delle cellule latentemente infette a partire da CD4 primari;
  2. usato il SAHA (e in certi esperimenti anche il disulfiram) per riattivare l’HIV-1 latente nei CD4 quiescenti;
  3. scoperto che LA RIATTIVAZIONE DEL VIRUS NON COMPORTA DI PER SÉ LA MORTE DELLE CELLULE INFETTE: i CTL dei pazienti in HAART non sono riusciti ad uccidere i CD4 autologhi latentemente infetti dopo la riattivazione del virus latente;
  4. ipotizzato, quindi, che LA RIATTIVAZIONE DELL’HIV-1 LATENTE NON RIESCA A RIPULIRE IL RESERVOIR;
  5. dedotto che LA STIMOLAZIONE DI RISPOSTE CTL PRIMA DELLA RIATTIVAZIONE DEL VIRUS POSSA ESSERE UN PASSO ESSENZIALE PER L’ERADICAZIONE.

(...) In sostanza, la riattivazione del virus latente è soltanto il primo passo verso l’eradicazione: bisogna anche riuscire ad eliminare le cellule in cui il virus è stato risvegliato dalla latenza. Ma quel che Siliciano ha scoperto è che queste non muoiono, dopo la riattivazione, né grazie agli effetti citopatici del virus, né grazie alla reazione dei CD8 dei pazienti in terapia antiretrovirale.

Nei giorni scorsi, mi è capitato di leggere un articolo che Siliciano, insieme a Robert Buckheit e Joel Blankson - sempre Johns Hopkins University School of Medicine - ha appena pubblicato su Retrovirology: Primary CD8+ T cells from elite suppressors effectively eliminate non-productively HIV-1 infected resting and activated CD4+ T cells.
È una ricerca dedicata a comprendere i meccanismi attraverso cui gli elite controllers (o “suppressors” – come vengono chiamati nell’articolo) riescono a mantenere la viremia al di sotto della soglia di rilevabilità dei test standard (< 50 copie/mL) pur in assenza di terapia. Questo genere di studi non ha un fine meramente accademico, ma serve per arrivare a definire le caratteristiche di un vaccino efficace.
L’articolo ha attirato la mia attenzione perché da quando, un anno e mezzo fa, Siliciano ha fatto scoppiare la bomba del fatto che la riattivazione del virus non comporta di per sé la morte delle cellule infette, è iniziata da parte di numerosi gruppi di ricerca la corsa a dimostrare che il loro (candidato) vaccino terapeutico ha la capacità di rafforzare i CD8 e può essere utilizzato in una strategia complessa di eradicazione, insieme a una qualche sostanza che risvegli il virus dalla latenza.

Anticipo subito che a Siliciano, fra tutti i vari candidati, pare piacere in particolare il vaccino al CMV di Louis Picker, che tante soddisfazioni sta dando nei macachi e cui noi abbiamo dedicato un intero thread (Louis Picker, le "scimmie di Portland" e il vaccino al CMV).

Questo lavoro di Siliciano è open access, quindi chi lo desidera può vederselo nei dettagli più tecnici. Io ne racconto soltanto il razionale e le conclusioni.

• • Si sa che una migliore risposta dei CD8 si associa a un miglior controllo della replicazione dell’HIV.
  • Si sa, inoltre, che l’HLA-B*57 è un allele sovra-rappresentato nelle coorti di elite suppressors ed è uno degli elementi che più contribuiscono al controllo della replicazione virale.
  • E si è visto che i CD8 degli elite, senza minimamente essere stimolati, sono più efficaci nel sopprimere la replicazione del virus rispetto ai CD8 di chi ha una normale progressione dell’infezione.
  • Infine, studi su un modello di macachi elite suppressors hanno dimostrato che se si distruggono i CD8 mediante un anticorpo monoclonale si perde il controllo della viremia (cfr. Modello di scimmie elite controller per cura funzionale).

Mentre gli elite riescono a mantenere livelli di HIV RNA nel sangue paragonabili a quelli delle persone in terapia antiretrovirale, hanno invece sia un numero più basso di cellule latentemente infette (da 10 a 50 volte meno) in circolazione nel sangue, sia livelli significativamente più bassi di DNA provirale integrato.
È possibile che siano i più bassi picchi di viremia durante la fase acuta dell’infezione a spiegare la minor frequenza di cellule latentemente infette rilevata negli elite. Ma è anche possibile che entrino in gioco altri meccanismi.

In un modello di latenza su cellule primarie, si è visto che i CD8 degli elite erano più efficaci nel colpire le cellule latentemente infette riattivate. E poi Picker ha dimostrato un fantastico controllo della replicazione dell’SIV in alcuni dei suoi macachi vaccinati e questo controllo non è venuto meno quando i CD8 sono stati distrutti usando degli anticorpi, tanto che i CD4 risultati infetti durante l’autopsia erano così pochi che si può pensare che il virus sia stato realmente eradicato.

L’ipotesi di Siliciano è che i CD8 degli elite siano capaci di eliminare i CD4 infetti che sono precursori delle cellule latentemente infette. È possibile che la latenza si stabilisca o quando dei CD4 infetti tornano a uno stato quiescente, che non permette l’espressione genetica del virus, oppure attraverso un’infezione diretta dei CD4 non attivati. In entrambi i casi, l’eliminazione dei CD4 subito dopo l’infezione e prima che alcun gene virale venga espresso dovrebbe impedire che si stabilisca la latenza [quello che – presumibilmente – è accaduto alla bimba curata in Mississippi].
È già stato dimostrato sia nei modelli animali nel caso dell’SIV, sia su linee cellulari nel caso dell’HIV che i CD8 sono capaci di distruggere subito, agli esordi dell’infezione, le cellule infette in modo non produttivo (cioè i CD4 non attivati). Quello che non era ancora chiaro è se i CD8 degli elite siano in grado di mediare questo tipo di risposta.

In questo studio, Siliciano e colleghi sono riusciti a dimostrare che i CD8 di elite suppressors HLA-B*57 positivi sono capaci di eliminare sia i CD4 attivati, sia i CD4 quiescenti non-produttivamente infetti, pur senza essere stati in alcun modo pre-stimolati. Cosa che invece non si è vista nel caso delle persone con progressione normale della malattia, avessero o meno l’allele HLA-B*57, quando i loro CD8 sono stati messi in coltura insieme ai CD4 appena infettati.

La conclusione è che una potente e precoce risposta dei CD8 che colpisce le cellule latentemente infette può essere un meccanismo che contribuisce al controllo virale degli elite e che spiega almeno in parte perché gli elite abbiano piccoli reservoir di cellule latentemente infette.
Se questo risultato viene letto insieme al lavoro di Picker, si capisce perché tanto più importante diventi trovare un vaccino o una qualche altra immunoterapia efficace nel rafforzare le risposte dei CD8 quando si sperimenta una sostanza che risveglia il virus dalla latenza all’interno di una strategia di eradicazione.

[skydrake]

Permesso che non ho ancora letto lo studio di Siliciano, trovo oscura questa parte:

In questo studio, Siliciano e colleghi sono riusciti a dimostrare che i CD8 di elite suppressors HLA-B*57 positivi sono capaci di eliminare sia i CD4 attivati, sia i CD4 quiescenti non-produttivamente infetti, pur senza essere stati in alcun modo pre-stimolati. Cosa che invece non si è vista nel caso delle persone con progressione normale della malattia, avessero o meno l’allele HLA-B*57, quando i loro CD8 sono stati messi in coltura insieme ai CD4 appena infettati.

Sopratutto non ho capito come fanno i CD8 a distinguere i CD4 latentemente latenti da quelli non infetti.

[Dora]

Sopratutto non ho capito come fanno i CD8 a distinguere i CD4 latentemente latenti da quelli non infetti.

È una domanda bellissima cui non so rispondere. Mi lasci il tempo di studiare un po'?

[Dora]

Sopratutto non ho capito come fanno i CD8 a distinguere i CD4 latentemente latenti da quelli non infetti.

È una domanda bellissima cui non so rispondere. Mi lasci il tempo di studiare un po'?

Ho riletto bene l’articolo e credo di poterti rispondere che – infatti – i CD8 non riconoscono come nemico i CD4 quiescenti latentemente infetti.
Tutto si gioca sulla distinzione fra cellule latentemente infette, che restano invisibili all’azione citolitica del sistema immunitario, e cellule NON-produttivamente infette che, se ho capito bene, sono sulla via di entrare in stato di quiescenza, durante il quale il virus che le ha infettate non si trascrive.
E tutto questo processo dura poco. È per questo che i CD8 degli elite HLA-B*57+ studiati da Siliciano dimostrano di avere una marcia in più di quelli dei progressori normali: perché sono rapidissimi a riconoscere i CD4 che si stanno trasformando in quiescenti e a distruggerli prima che scompaiano dalla loro vista.

Questo tipo di risposte dei CD8 di questi particolari elite (non dimentichiamo che ci sono anche degli elite B*57 negativi) possono spiegare la bassa frequenza di cellule latentemente infette che è stata osservata negli elite controllers. Cioè i loro CD8 riescono ad eliminare i CD4 attivati, produttivamente infetti - e questo limita il livello della viremia e il successivo instaurarsi di un reservoir. Ma sono anche capaci di eliminare i CD4 NON-produttivamente infetti che, una volta completato il processo di quiescenza, potrebbero trasformarsi in un reservoir.

Per rendere la cosa concretamente più interessante: se si riesce a creare un vaccino basato sui CD8 che sia capace di sollecitare una risposta potente molto in fretta, questo potrebbe impedire il crearsi di un reservoir latente esteso [direi che è per questo che a Siliciano piace il vaccino di Picker, per la continua sollecitazione che il CMV come vettore persistente riesce ad esercitare sui CD8 - cfr. in particolare qui].

[nordsud]

Bob Siliciano, M.D., who has really pioneered a lot of the latency research, did present a new model suggesting that if you can push down the levels of the reservoir by several logs it would predict at least a delay, possibly of several years, in the rebound of virus. That's obviously something that needs to be further confirmed as interventions develop which reduce the reservoir.

Non capisco questa "sparata". In teoria anche sole 10 ( direi anche 2 o una sola ) cellule hiv infette sono più che abbastanza per infettare moltissime altre in maniera logaritmica.
Vediamo quanti altri casi di persone "functional cured o remission drugs free" salteranno fuori nei prossimi mesi. Non mi meraviglierei se da un paio di decine arrivassero ad un centinaio nel giro di qualche mese. Ho sentito di persone in Italia che dopo aver smesso la haart ( iniziata anche dopo la fase cronica secondo alcune voci ... speriamo sia vero...) sono ancora senza viremia anche dopo anni. Potrebbero essere loro considerati i prossimi functional cured ?

[Dora]

Bob Siliciano, M.D., who has really pioneered a lot of the latency research, did present a new model suggesting that if you can push down the levels of the reservoir by several logs it would predict at least a delay, possibly of several years, in the rebound of virus. That's obviously something that needs to be further confirmed as interventions develop which reduce the reservoir.

Non capisco questa "sparata". In teoria anche sole 10 ( direi anche 2 o una sola ) cellule hiv infette sono più che abbastanza per infettare moltissime altre in maniera logaritmica.

Non è una sparata. L'ha detto tante volte, l'ultima mi pare al CROI. E non è neppure il solo a dirlo: se si riesce a svuotare abbastanza il reservoir e magari a rinforzare le reazioni dei CD8, si può ben pensare che poi il sistema immunitario faccia da solo nel mantenere la replicazione virale a livelli bassissimi. E' l'idea della cura funzionale, no?

Vediamo quanti altri casi di persone "functional cured o remission drugs free" salteranno fuori nei prossimi mesi. Non mi meraviglierei se da un paio di decine arrivassero ad un centinaio nel giro di qualche mese. Ho sentito di persone in Italia che dopo aver smesso la haart ( iniziata anche dopo la fase cronica secondo alcune voci ... speriamo sia vero...) sono ancora senza viremia anche dopo anni. Potrebbero essere loro considerati i prossimi functional cured ?

Penso proprio di sì.
E credo anche che, con l'appello che Saez Cirion ha lanciato a tutti gli infettivologi a notificargli i casi di persone che hanno iniziato presto la ART e poi l'hanno sospesa senza avere un rebound quasi immediato della viremia, di "functionally cured" prossimamente ne vedremo tanti. Lo spero, almeno.

Comunque sia, il fantasma del *paziente sfigato di Chun* aleggia sempre da queste parti.

A proposito, la premiata ditta Chun-Fauci ha appena pubblicato su JID uno studio sugli effetti della ART sui reservoir degli elite. È carino, magari ne scrivo nei prossimi giorni.