Come ogni essere vivente, i batteri vengono infettati da virus – chiamati appunto batteriofagi – e, durante l’evoluzione, oltre al sistema immunitario innato ne hanno sviluppato uno acquisito ed ereditabile. Nei batteri le cose vanno così: il loro principale sistema di difesa sono degli enzimi di restrizione che, come forbici molecolari, “tagliano” le due eliche del DNA del virus invasore una volta che questo si è insediato nella cellula. Ma poi il sistema immunitario acquisito tiene memoria delle infezioni passate integrando parte del DNA del virus nel genoma del batterio. In questo modo il batterio si immunizza contro quel virus: se si ripresenta lo stesso batteriofago, usa quei pezzi di DNA per neutralizzarlo subito. L’altro aspetto meraviglioso di questo sistema è che viene trasmesso anche alle cellule figlie quando il batterio si divide.
A fine anni ’80, dei ricercatori giapponesi s’imbatterono in una strana sequenza ripetitiva alla fine di un gene dell’Escherichia coli, ma non se ne comprese il significato finché non fu possibile sequenziare i genomi di tanti microbi diversi e si osservò che molti batteri condividevano queste misteriose ripetizioni.
La scoperta risolutiva è stata fatta una decina d’anni fa alla Danisco, un’industria alimentare danese che stava cercando di migliorare la propria produzione di yoghurt e formaggi. I suoi ricercatori scoprirono che i batteri che utilizzavano erano meno resistenti ai virus quando nel loro DNA mancavano certe sequenze ripetute, che si ritrovavano identiche nel DNA dei loro predatori. Chiamarono queste sequenze CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats – brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallate raggruppate) e ipotizzarono che costituissero parte di un sistema di difesa dei batteri che, grazie a queste sequenze di DNA, riconoscono in modo specifico e preciso le medesime sequenze presenti nel genoma del virus.
Di lì partirono ricerche in diversi laboratori in giro per il mondo e soprattutto nel laboratorio di Jennifer Doudna a Berkeley, che portarono a comprendere che i pezzi di DNA virale inglobati nel DNA batterico sono trascritti come RNA, ma vengono intercettati da un enzima chiamato Cas9, che li usa come guida per riconoscere il DNA del batteriofago e farlo a pezzi (degradarlo).
Si osservò, inoltre, che esistono diversi sistemi CRISPR/Cas in diverse specie di batteri e tutti prevedono qualche piccolo RNA CRISPR non-codificante(crRNA) e un insieme di proteine Cas.
Si era così scoperto il sistema CRISPR/Cas, una tecnologia che permette di modificare i cromosomi di piante e animali, tagliando una qualsiasi sequenza di DNA in qualsiasi punto si voglia, purché si sappia costruire un RNA complementare corrispondente, un RNA chimera chiamato RNA guida (gRNA).
In chi sta seguendo gli studi di Sangamo sulla distruzione mediante nucleasi a dita di zinco (ZFN) del gene che codifica per il recettore CCR5 nei CD4 e nelle staminali, la distruzione di pezzi di DNA mediante enzimi dovrebbe suonare familiare. Le ZFN, però, non usano guide a RNA prodotte secondo necessità e montate sempre sullo stesso enzima Cas9. Richiedono infatti la costruzione di un enzima specifico per la sequenza di DNA che si vuole distruggere, quindi sono uno strumento molto più macchinoso e costoso.
Il sistema CRISPR/Cas9 richiede solo due componenti: l’enzima Cas9 per tagliare la sequenza di DNA voluta e una molecola di RNA guida che si lega all’obiettivo grazie alla complementarietà. L’RNA guida forma un complesso con il Cas9 e dirige l’enzima proprio verso la sequenza di DNA che si vuole tagliare. La rottura del DNA causa di solito delle mutazioni che inattivano il gene; ma se si devono curare malattie genetiche è anche possibile introdurre nuove sequenze, ridisegnando i geni come si vuole.
Grazie alla sua semplicità e flessibilità, negli ultimi due anni questa tecnologia si è imposta nei laboratori come quella più attraente, innescando una specie di rivoluzione che probabilmente renderà a breve le ZFN, le TALEN e la stessa, usatissima, interferenza a RNA degli strumenti obsoleti (la RNAi, ad esempio, non consente un silenziamento permanente del gene target, mentre basta un solo trattamento con ZFN, TALEN o CRISPR per ottenerne la distruzione definitiva).
Come qualsiasi strumento, il sistema CRISPR/Cas9, oltre ai tanti pregi, ha anche qualche possibile limite.
L’efficacia nella distruzione del gene è uno dei principali requisiti di uno strumento di ingegneria genetica. Nei pochi lavori pubblicati in questi anni, si è visto che la frequenza di modificazione dei geni del sistema CRISPR/Cas9 è comparabile a quella delle ZFN o delle TALEN. D’altra parte, però, non è ancora ben chiaro quanti effetti off-target (distruzione di un gene simile, che invece deve essere preservato) si possano verificare, anche se da quanto si è visto finora pare che la specificità sia molto alta, gli errori molto pochi e dipendenti dalla quantità di Cas9 che si utilizza, e la tossicità sulle cellule non significativa.
Continua nel prossimo post (e la bibliografia è lì).
ma quindi questa tecnica sarebbe applicabile a qualunque tipo di virus o retrovirus??
Grazie Dora e speriamo bene