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MessaggioInviato: giovedì 13 novembre 2014, 9:30 
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Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48
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Gira e rigira, continuiamo a imbatterci nello yoghurt. Ma questa volta di *magie* o buffonate non ce ne sono e si seguono le vie della scienza.

Come ogni essere vivente, i batteri vengono infettati da virus – chiamati appunto batteriofagi – e, durante l’evoluzione, oltre al sistema immunitario innato ne hanno sviluppato uno acquisito ed ereditabile. Nei batteri le cose vanno così: il loro principale sistema di difesa sono degli enzimi di restrizione che, come forbici molecolari, “tagliano” le due eliche del DNA del virus invasore una volta che questo si è insediato nella cellula. Ma poi il sistema immunitario acquisito tiene memoria delle infezioni passate integrando parte del DNA del virus nel genoma del batterio. In questo modo il batterio si immunizza contro quel virus: se si ripresenta lo stesso batteriofago, usa quei pezzi di DNA per neutralizzarlo subito. L’altro aspetto meraviglioso di questo sistema è che viene trasmesso anche alle cellule figlie quando il batterio si divide.

A fine anni ’80, dei ricercatori giapponesi s’imbatterono in una strana sequenza ripetitiva alla fine di un gene dell’Escherichia coli, ma non se ne comprese il significato finché non fu possibile sequenziare i genomi di tanti microbi diversi e si osservò che molti batteri condividevano queste misteriose ripetizioni.

La scoperta risolutiva è stata fatta una decina d’anni fa alla Danisco, un’industria alimentare danese che stava cercando di migliorare la propria produzione di yoghurt e formaggi. I suoi ricercatori scoprirono che i batteri che utilizzavano erano meno resistenti ai virus quando nel loro DNA mancavano certe sequenze ripetute, che si ritrovavano identiche nel DNA dei loro predatori. Chiamarono queste sequenze CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats – brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallate raggruppate) e ipotizzarono che costituissero parte di un sistema di difesa dei batteri che, grazie a queste sequenze di DNA, riconoscono in modo specifico e preciso le medesime sequenze presenti nel genoma del virus.

Di lì partirono ricerche in diversi laboratori in giro per il mondo e soprattutto nel laboratorio di Jennifer Doudna a Berkeley, che portarono a comprendere che i pezzi di DNA virale inglobati nel DNA batterico sono trascritti come RNA, ma vengono intercettati da un enzima chiamato Cas9, che li usa come guida per riconoscere il DNA del batteriofago e farlo a pezzi (degradarlo).
Si osservò, inoltre, che esistono diversi sistemi CRISPR/Cas in diverse specie di batteri e tutti prevedono qualche piccolo RNA CRISPR non-codificante(crRNA) e un insieme di proteine Cas.

Si era così scoperto il sistema CRISPR/Cas, una tecnologia che permette di modificare i cromosomi di piante e animali, tagliando una qualsiasi sequenza di DNA in qualsiasi punto si voglia, purché si sappia costruire un RNA complementare corrispondente, un RNA chimera chiamato RNA guida (gRNA).

In chi sta seguendo gli studi di Sangamo sulla distruzione mediante nucleasi a dita di zinco (ZFN) del gene che codifica per il recettore CCR5 nei CD4 e nelle staminali, la distruzione di pezzi di DNA mediante enzimi dovrebbe suonare familiare. Le ZFN, però, non usano guide a RNA prodotte secondo necessità e montate sempre sullo stesso enzima Cas9. Richiedono infatti la costruzione di un enzima specifico per la sequenza di DNA che si vuole distruggere, quindi sono uno strumento molto più macchinoso e costoso.

Il sistema CRISPR/Cas9 richiede solo due componenti: l’enzima Cas9 per tagliare la sequenza di DNA voluta e una molecola di RNA guida che si lega all’obiettivo grazie alla complementarietà. L’RNA guida forma un complesso con il Cas9 e dirige l’enzima proprio verso la sequenza di DNA che si vuole tagliare. La rottura del DNA causa di solito delle mutazioni che inattivano il gene; ma se si devono curare malattie genetiche è anche possibile introdurre nuove sequenze, ridisegnando i geni come si vuole.

Immagine

Grazie alla sua semplicità e flessibilità, negli ultimi due anni questa tecnologia si è imposta nei laboratori come quella più attraente, innescando una specie di rivoluzione che probabilmente renderà a breve le ZFN, le TALEN e la stessa, usatissima, interferenza a RNA degli strumenti obsoleti (la RNAi, ad esempio, non consente un silenziamento permanente del gene target, mentre basta un solo trattamento con ZFN, TALEN o CRISPR per ottenerne la distruzione definitiva).

Come qualsiasi strumento, il sistema CRISPR/Cas9, oltre ai tanti pregi, ha anche qualche possibile limite.

L’efficacia nella distruzione del gene è uno dei principali requisiti di uno strumento di ingegneria genetica. Nei pochi lavori pubblicati in questi anni, si è visto che la frequenza di modificazione dei geni del sistema CRISPR/Cas9 è comparabile a quella delle ZFN o delle TALEN. D’altra parte, però, non è ancora ben chiaro quanti effetti off-target (distruzione di un gene simile, che invece deve essere preservato) si possano verificare, anche se da quanto si è visto finora pare che la specificità sia molto alta, gli errori molto pochi e dipendenti dalla quantità di Cas9 che si utilizza, e la tossicità sulle cellule non significativa.







Continua nel prossimo post (e la bibliografia è lì).


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MessaggioInviato: giovedì 13 novembre 2014, 9:33 
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Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48
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L’interesse sollevato da questa tecnologia per arrivare a una cura dell’infezione da HIV è, al momento, duplice: da un lato si pensa di poterla utilizzare in futuro per distruggere il genoma dell’HIV integrato nelle cellule quiescenti latentemente infette (qualcosa di analogo a quanto stiamo vedendo per le endonucleasi di homing); dall’altro se ne sta progettando un uso simile a quello già visto per le ZFN: la distruzione del gene che codifica per il co-recettore CCR5 sui linfociti T CD4+ e sulle cellule staminali/progenitrici CD34+.

L'estate scorsa, un lavoro della Temple University - RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection - di cui parlammo in "Scoperte" ha iniziato a introdurci al sistema CRISPR/Cas9.

Non era la prima volta che CRISPR-Cas9 veniva usato per distruggere l’HIV latente, perché già nel 2013 dei ricercatori della Kyoto University pubblicarono un report su Nature, in cui riferivano di avere lavorato su modelli cellulari e di avere osservato sia una perdita di espressione genica dell’HIV quando ne avevano distrutto l’LTR mediante CRISPR/Cas9, sia una estirpazione dei geni del virus dai cromosomi delle cellule in cui si era integrato.
Molto correttamente questi scienziati giapponesi, pur sottolineando che l’estirpazione del provirus dal genoma della cellula ospite poteva offrire “un raggio di speranza” per eradicare l’HIV dalle persone che ne sono infette, non nascosero i limiti del loro lavoro, ammettendo che

    “ci sono diversi ostacoli da superare prima di utilizzare la modificazione del genoma in terapie di eradicazione dell’HIV-1 quali la terapia genica. Anzitutto, l’efficienza della modificazione del genoma e/o l’estirpazione del provirus deve essere quantificata in cellule primarie latentemente infette, compresi i CD4 quiescenti latentemente infetti. In secondo luogo, si deve sviluppare un sistema di trasporto efficiente. Fortunatamente, il sistema CRISPR/Cas9 ha un vantaggio di dimensioni rispetto alle TALEN. Quindi può essere trasportato da vettori lentivirali, mentre le TALEN non possono a causa delle loro ampie dimensioni e della ripetizione delle sequenze. L’ultimo ostacolo riguarda i possibili effetti off-target, una preoccupazione per tutte le strategie di modificazione del genoma, che possono comportare modificazioni non specifiche di geni.”

Quando nel luglio scorso uscì sui PNAS il lavoro della Temple University ci fu un profluvio di articoli di stampa, dai quali le legittime preoccupazioni espresse nel lavoro della Kyoto University pareva fossero magicamente scomparse.
Kamel Khalili e colleghi sostenevano di avere superato i problemi di insufficiente specificità che portavano a possibili effetti off-target, e dunque a tossicità, combinando diversi approcci per identificare i bersagli dell’HIV contro cui scatenare l’attacco della Cas9 e riuscendo così a creare un metodo basato sulla Cas9, che si era dimostrato capace di eradicare l’HIV DNA integrato dalle cellule latentemente infette e anche di impedire che le cellule si infettassero di nuovo. E sostenevano di esserci riusciti con alta specificità ed efficienza.

Avevano lavorato soprattutto su cellule della linea mieloide (microglia/macrofagi), che costituiscono il maggiore reservoir di HIV latente nel cervello e sono particolarmente difficili da trattare. Ma ritenevano che questa loro proof of concept fosse applicabile a qualsiasi altro tipo di cellule, compresi i linfociti T, gli astrociti e le staminali neurali.
Oltre alla completa ablazione dei provirus dell’HIV integrati nel genoma delle cellule, il passo avanti rispetto alla ricerca giapponese era stato la dimostrazione che se il genoma viene modificato con il sistema Cas9/gRNA si riesce a immunizzare la cellula dall’infezione da parte del virus. In sostanza, accadrebbe quello che accade ai batteri: quando l’HIV cerca di integrarsi nel genoma di una cellula trattata con Cas9/gRNA, viene immediatamente distrutto.

Mentre per Koyanagi e colleghi il loro lavoro offriva semplicemente “un raggio di speranza”, Khalili e colleghi terminavano il loro articolo sostenendo che si potevano esplorare vari sistemi di trasporto del Cas9/LTR-gRNA per arrivare a immunizzare i soggetti ad alto rischio di infezione e, data la facilità con cui si possono sviluppare i sistemi Cas9/gRNA, immaginavano che si potrà presto fare una genotipizzazione delle varianti di HIV-1 per avere una terapia personalizzata per ciascun paziente. Dichiararono inoltre di avere fatto abbastanza esperienza sulle cellule e di essere pronti a passare a sperimentare sugli animali.

A me quell’articolo parve concludersi con un delirio di onnipotenza e, quando ne parlammo a luglio, provai a riportare quella ricerca con i piedi per terra.

    1. Anzitutto, Khalili e colleghi sembrano trascurare il fatto che il loro successo è stato parziale, perché ha funzionato solo nella metà dei casi, sia per quanto riguarda l’escissione del DNA virale integrato nel genoma della cellula ospite, sia per quanto riguarda la protezione da infezioni future delle cellule trattate. La variabilità genetica dell’HIV non è una questione da sottovalutare, perché la tecnica CRISPR/Cas9 è costruita per colpire una specifica sequenza genica, che può mancare non solo in altre varianti di virus circolanti nel mondo, ma anche nei virus presenti nella medesima persona.
    2. In secondo luogo, anche se questa tecnologia pare davvero molto precisa, il rischio di danneggiare altri geni oltre a quelli che si intendono colpire è sempre in agguato. Quindi la questione degli effetti off-target dovrà essere studiata in modo molto più approfondito.
    3. In terzo luogo, una cosa è modificare il genoma di una cellula in laboratorio; altra cosa è trasportare CRISPR/Cas9 fino a tutte le cellule latentemente infette infrattate nei posti più remoti e difficilmente accessibili di un organismo vivente.

La prima e la terza riserva vengono meno e alla seconda si cerca di cominciare a dare una risposta nel caso di un nuovo lavoro su CRISPR/Cas9 pubblicato la settimana scorsa su Cell Stem Cell da alcuni ricercatori di Harvard, che usano questa tecnologia per affrontare la seconda sfida in cui la terapia genica potrebbe consentire di arrivare a curare l’infezione da HIV: la distruzione del co-recettore CCR5 su CD4 e staminali (Efficient Ablation of Genes in Human Hematopoietic Stem and Effector Cells using CRISPR/Cas9).

Chad Cowan, Derrik Rossi e colleghi hanno dimostrato di poter distruggere il CCR5 da CD4 e staminali, che hanno poi dato vita a una progenie di cellule prive del co-recettore, che sono tutte perfettamente funzionanti e che, analizzate con tecniche di sequenziamento molto approfondite, non presentano mutazioni indesiderate e dunque sembrano sicure.
I passi avanti rispetto a quanto visto finora sono:

    1. le cellule erano cellule primarie, non linee cellulari;
    2. non c’è bisogno di andare a stanare cellule nascoste chissà dove: basta prelevare sangue e/o midollo da una persona, separare le staminali e i CD4, modificarli e reinfonderli – come si sta facendo da tempo in tanti altri studi di terapia genica;
    3. le staminali modificate sono state testate in 6 diverse condizioni sperimentali per indagare gli effetti off-target, sono stati fatti 3400 sequenziamenti di siti del genoma che potrebbero confondere CRISPR mentre cerca di distruggere il gene CCR5 (mentre di solito quando si sequenzia l’intero genoma se ne fanno 50) e il rischio di distruzioni aberranti è stato pari a zero;
    4. la desiderata distruzione del CCR5 è stata altissima.

Immagine

A Harvard sono meno disposti a fare fughe in avanti rispetto a Temple quindi, pur ritenendo di poter arrivare nel giro di qualche anno a una sperimentazione clinica in cui testare la sicurezza di quella che chiamano la “versione 1.0 di CRISPR”, ammettono onestamente che è meglio andarci cauti, perché possono sorgere complicazioni inattese e la storia dell’epidemia di HIV/AIDS è già abbastanza piena di presunte “cure” che si sono rivelate non aver curato nulla.
Insieme al Rangon Institute si faranno test su topi umanizzati e, quando questi avranno avuto successo, si potrà parlare di un trial su esseri umani.




FONTI:



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MessaggioInviato: giovedì 13 novembre 2014, 11:35 
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che lettura affascinante!
certo, l'activia alla fiorentina/guernseyesca è più ruspante però :lol:


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MessaggioInviato: giovedì 13 novembre 2014, 12:24 
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uffa2 ha scritto:
che lettura affascinante!
certo, l'activia alla fiorentina/guernseyesca è più ruspante però :lol:

Non vorrei aver fornito nuovi stimoli alle invenzioni degli yoghurtari e ritrovarci con *happy bacteria* che, invece di produrre banale GcMAF, sfornano CRISPR/Cas9 pronte a curare la qualunque. :mrgreen:


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MessaggioInviato: giovedì 13 novembre 2014, 13:30 
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Iscritto il: giovedì 19 dicembre 2013, 19:58
Messaggi: 3452
Cavolo, tutto ciò è davvero molto affascinante. Mi ha davvero lasciato senza parole! Se non altro, si tratta di un nuovo e più speranzoso (forse anche scientificamente più valido di altri) approccio al tema.
Grazie Dora, se tu non ci fossi, bisognerebbe inventarti ;)


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MessaggioInviato: venerdì 14 novembre 2014, 21:37 
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:shock: ma quindi questa tecnica sarebbe applicabile a qualunque tipo di virus o retrovirus??


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MessaggioInviato: sabato 15 novembre 2014, 7:29 
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rospino ha scritto:
Grazie Dora, se tu non ci fossi, bisognerebbe inventarti ;)

Grazie a te, Rospino.

dannato ha scritto:
:shock: ma quindi questa tecnica sarebbe applicabile a qualunque tipo di virus o retrovirus??

Certo, perché no? Purché si riesca a costruire l'RNA guida adatto e si trovi il modo di portare il complesso con la Cas9 dove serve.
Ad esempio, stanno usando CRISPR/Cas9 per inattivare due geni dell'HPV in cellule di carcinoma della cervice, stanno togliendo e aggiungendo geni all'Herpes simplex come già hanno fatto con Epstein Barr, CMV e un paio d'altre bestiacce, e c'è pure chi sta studiando il modo di attaccare anche virus che non si integrano nel genoma:

http://jvi.asm.org/content/early/2014/0 ... 9-14.short
http://today.duke.edu/2014/08/crisprhpv

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1 ... 0/abstract

http://www.plospathogens.org/article/in ... at.1004090

Insomma, caro Dannato, le possibilità di CRISPR sono probabilmente immense e ancora tutte da esplorare.


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MessaggioInviato: sabato 15 novembre 2014, 10:03 
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:) Grazie Dora e speriamo bene


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MessaggioInviato: sabato 15 novembre 2014, 15:54 
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La genetica sarà la cura a tutti i nostri mali, tra qualche decennio… Il problema saranno i costi. :?


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MessaggioInviato: sabato 15 novembre 2014, 17:44 
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ThunderGuy ha scritto:
La genetica sarà la cura a tutti i nostri mali, tra qualche decennio… Il problema saranno i costi. :?

Io credo che questo sia un falso problema, così come è un falso problema quello della "scalabilità" della cura. E penso che ragionamenti di questo tipo siano un po' come quelli fatti dal servizio del TG4 su Rosetta l'altro giorno: mentre il mondo trepidava per l'accometaggio di Philae per la prima volta nella storia umana, il TG4 si rammaricava per i costi (3,5 euro - 0,35 all'anno - per ogni cittadino europeo!!) e arrivava a vergognarsi che ci fosse tanta tecnologia italiana lassù nello spazio, a mezzo miliardo di km da noi.

Le obiezioni su costi e scalabilità sono le stesse che venivano avanzate contro la diffusione degli antiretrovirali ai Paesi poveri e si è visto che, nel momento in cui i farmaci sono stati resi disponibili, nel tempo si è trovato il modo per portarli dove servono, a prezzi che i Paesi poveri sono in grado di sostenere. Non si è raggiunta una copertura completa, purtroppo molte persone che ne hanno bisogno ancora non hanno accesso agli antiretrovirali, ma nessuno può sostenere che sia per i costi troppo alti.

Ché si diano milioni e se servono anche miliardi di dollari alla ricerca, ché una cura venga trovata, poi si troverà il modo di abbassarne i costi.


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