[STUDI]Cannon_trapianto staminali umane rese CCR5- in topi 2

Ricerca scientifica finalizzata all'eradicazione o al controllo dell'infezione.
Dora
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[STUDI]Cannon_trapianto staminali umane rese CCR5- in topi 2

Messaggio da Dora » mercoledì 24 agosto 2011, 19:37

Questa è la continuazione del thread [STUDI] Cannon: trapianto staminali umane rese CCR5- in topi, che può essere trovato a questo indirizzo: http://hivforum.0sites.net/Lilanew/viewtopic.php?t=4268

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Where are we in the search for the cure for HIV?


Una lezione in sei parti, tenuta da Paula Cannon il 5 maggio scorso al Center for AIDS di Houston (http://www.centerforaids.org/) e pubblicata sul canale YouTube di Program for Wellness.
E' lunga, ma molto chiara e riassume tutti i temi della sua ricerca passata e futura.

https://www.youtube.com/watch?v=Iql5eRcKreM&feature=mfu_in_order&list=UL

https://www.youtube.com/watch?v=KeEPXc1t5wo&feature=related

https://www.youtube.com/watch?v=pAHaozN5xeU&feature=related

https://www.youtube.com/watch?v=IRlvOW0rBkk&feature=related

https://www.youtube.com/watch?v=PS_Wb_oBkFQ&feature=related

https://www.youtube.com/watch?v=vELSVmBE-30&feature=related
Ultima modifica di Dora il martedì 6 settembre 2011, 13:31, modificato 1 volta in totale.



Dora
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Re: [STUDI] Cannon: trapianto staminali umane rese CCR5- in

Messaggio da Dora » mercoledì 24 agosto 2011, 19:40

Nel terzo video la Cannon parla a lungo dell'utilità di sperimentare sui topi umanizzati.
Mi aggancio a questo, per ricordare che la questione dell’affidabilità dei modelli animali nella ricerca di sostanze che portino al risveglio dell’HIV dalla latenza e al purging dei reservoir è continuamente all’ordine del giorno. Paul Denton e J. Victor Garcia, della University of North Carolina, Chapel Hill, che da anni studiano i modelli murini e sono stati fra i primi a creare topi umanizzati, hanno appena pubblicato su AIDS reviews una rassegna dedicata proprio ai modelli di topi umanizzati nello studio dell’infezione da HIV (Humanized Mouse Models of HIV Infection).

Non sono riuscita a reperire il full text dell’articolo, quindi mi baso sull’abstract e su una recensione scritta da Vincent Kapoulos per il sito di Lafeuillade (The Last Stop Before Starting Eradication Trials in Humans).

Antefatto: è appena partita la contestatissima sperimentazione clinica del SAHA (Merck) in funzione eradicante diretta da David Margolis, pure lui University of North Carolina, Chapel Hill di cui abbiamo a parlato a lungo.
Come ricorderete, da mesi si discute se sia già possibile sperimentare su esseri umani sostanze che risveglino il virus dalla latenza o se si debbano ancora indagare aspetti importanti, quali il reservoir presente nel cervello, per non trovarsi poi davanti a situazioni ingestibili con i pazienti che si prestano alle sperimentazioni.
Questa review di Denton e Garcia si inserisce nella discussione, portando chiarezza su un aspetto non marginale, quello della utilità e attendibilità delle prove sui topi cui è stato trapiantato un sistema immunitario umano e che possono quindi essere infettati dall’HIV, rispetto alle prove sui macachi infettati dall’SIV (o, al più, dall’SHIV).

Anzitutto, bisogna ricordare che l’infezione dei macachi con l’SIV fornisce un ottimo modello per studiare la patogenesi dell’HIV, perché i due virus sono simili a livello molecolare, la replicazione dell’SIV può essere inibita da molti dei farmaci che si usano contro l’HIV e il virus scimmiesco causa una sindrome da immunodeficienza che per molti aspetti è simile a quella umana. Il problema con i macachi, però, è duplice: 1) sono costosi e devono essere tenuti in stabulari speciali; 2) ci sono comunque delle differenze fra i due virus (per esempio, il gene Vpx appartiene solo all’SIV, mentre il gene Vpu soltanto all’HIV) e nel decorso della malattia (l’AIDS delle scimmie si sviluppa entro 6-12 mesi dal momento dell’infezione, mentre quella umana richiede in genere alcuni anni).

I topi, al contrario, costano poco, si riproducono in fretta e possono essere tenuti in ogni laboratorio. E, soprattutto, è stato possibile superare le barriere che rendevano difficile creare dei buoni modelli - in primo luogo la non infettabilità dei topi da parte dell’HIV - grazie alla creazione di topi “umanizzati”.

Esistono diversi modelli murini:
• topi wild-type, ma con uno o più transgeni umani;
• topi immunodeficienti cui vengono trapiantate cellule umane o impiantati tessuti umani;
• topi immunodeficienti cui vengono trapiantate cellule progenitrici ematopoietiche CD34+;
• varie combinazioni dei tre modelli precedenti.

Mentre la maggior parte delle cellule linfoidi si sviluppano nel midollo, i progenitori dei linfociti T escono dal midollo e migrano nel timo, dove arrivano a maturazione. Nei topi cui sono state trapiantate le CD34+, questo processo avviene nel timo del topo, anche se nei topi BLT (bone marrow, liver, thymus – midollo, fegato, timo) ha luogo in un timo umano impiantato nel topo e crea un sistema immunitario umano funzionante.

Questi modelli di topi umanizzati, che hanno il vantaggio di poter essere infettati con HIV e non con dei virus surrogati, hanno però delle limitazioni, in particolare la vita più breve rispetto a quella sia dei primati sia degli uomini.

Per generare topi umanizzati vengono usate tre varietà di topi immunodeficienti:
• topi NOD/SCID (non obesi, diabetici/con severa immunodeficienza combinata – cui, quindi, mancano i linfociti T e B endogeni);
• topi Rag2^null gamma^Cnull;
• topi NOD/SCID gamma^Cnull.

[Per esempio, i topi della Cannon erano NOD/SCID/IL-2Rgamma^null (NSG).]
Per generare topi umanizzati con CD34+ trapiantate, i topi subiscono un pre-condizionamento (mediante raggi gamma o busulfano) per creare una nicchia nel midollo, che possa accogliere le progenitrici ematopoietiche umane CD34+ raccolte dal cordone ombelicale, dal fegato dei feti o dal sangue periferico.

Nel caso dei topi BLT, ogni animale riceve dal medesimo donatore umano le CD34+ e i tessuti che vengono impiantati; indipendentemente dalla fonte da cui sono ricavate le CD34, il trapianto di progenitrici ematopoietiche fornisce una scorta di cellule immunitarie che dura per tutta la vita del topo.

Le cellule immunitarie umane – fra cui i linfociti T e B, le NK, le cellule mieloidi e quelle dendritiche – si trovano ovunque nei topi BLT. In particolare, l’intestino e il tratto riproduttivo delle femmine sono popolati dai linfociti T umani, rendendo questi topi particolarmente adatti allo studio sia della profilassi pre-esposizione, sia dei farmaci eradicanti, oltre che alla comprensione della biologia e della patogenesi dell’HIV (dall’analisi della replicazione virale alla valutazione dei fattori di restrizione dell’HIV, alla valutazione di nuovi regimi terapeutici)

Un altro aspetto che rende interessante il modello dei topi umanizzati è la possibilità di creare coorti multiple di topi a partire da molti donatori umani, in cui ciascuna coorte possiede le stesse cellule umane, consentendo di controllare le variabili intragenetiche.


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Re: [STUDI]Cannon_trapianto staminali umane rese CCR5- in to

Messaggio da Dora » martedì 11 ottobre 2011, 8:52

Ho accennato l’altro giorno al fatto che è uscito un nuovo lavoro sulla distruzione del CCR5 in staminali ematopoietiche trapiantate in topi che, a detta dei suoi autori – Erica Schleifman e Peter Glaser della Yale University - pare sia più sicuro delle nucleasi a dita di zinco (La proliferazione omeostatica non riattiva bene il reservoir).

Ne parlo qui, senza stare ad aprire un thread apposito, perché non soltanto si tratta di un lavoro ancora nelle sue fasi iniziali, ma devo anche ammettere che mi ha lasciato assai perplessa, non tanto per la metodica usata, che è complicatissima e della quale potrei non aver capito nulla, quanto per alcune affermazioni disseminate nell’articolo.

I lavori pubblicati, in realtà, sono due: uno sulla distruzione, mediante acidi peptidonucleici (PNA), del CCR5 in diversi tipi di cellule che lo esprimono (Targeted Disruption of the CCR5 Gene in Human Hematopoietic Stem Cells Stimulated by Peptide Nucleic Acids); e uno su un modo di trasportare questi PNA verso il loro bersaglio utilizzando nanoparticelle biodegradabili e non vettori virali (Nanoparticles Deliver Triplex-forming PNAs for Site-specific Genomic Recombination in CD34+ Human Hematopoietic Progenitors). Pur su riviste differenti, questi lavori escono insieme, firmati più o meno dalle stesse persone; TUTTAVIA, per portare i PNA a distruggere il CCR5 del primo lavoro NON sono state usate le nanoparticelle descritte nel secondo. Prima stranezza. Vabbè, dipenderà da qualche misteriosa coincidenza di tempi editoriali, se non dalla necessità accademica di aumentare a dismisura il numero delle pubblicazioni.

Ma le stranezze non finiscono qui.
Perché raccontare di questi lavori nel thread della Cannon? Perché la cosa più interessante del primo articolo è che è stato fatto un esperimento *simile* a quello della nostra Paula: sono state modificate delle staminali ematopoietiche umane e poi sono state trapiantate in topi umanizzati.
Ma andiamo per ordine e cerchiamo di capire brevemente che cosa sono questi PNA.
Gli acidi peptidonucleici sono una classe di molecole non naturali, ma di sintesi, che hanno struttura simile a quella del DNA e dell’RNA e hanno la capacità di legare il DNA con una forza superiore a quella fra i due filamenti del DNA. Vengono quindi utilizzati per costruire delle molecole in grado di legare e inibire il DNA, alterando l’espressione di un gene (cfr. Wiki).

Schleifman e Glaser hanno testato alcuni PNA opportunamente scelti per legarsi al gene che codifica per il CCR5, e l’hanno fatto su tre tipi di cellule: le THP-1, che sono una linea di cellule leucemiche umane, che esprimono il CCR5 e possono essere infettate dall’HIV, le K562, un’altra linea cellulare umana e delle staminali ematopoietiche CD34+.

Mediante trasfezione (cioè il processo di introduzione di materiale biologico esogeno nelle cellule), e precisamente mediante nucleofezione, che è un metodo di trasfezione che permette il transfer di acidi nucleici entro le cellule, hanno alterato il CCR5 con i PNA e, misurando il successo dell’operazione con metodi diversi (a livello di DNA, di RNA e di proteine), il massimo che sono riusciti ad ottenere è stata la modificazione di un allele nel 2,46% dei casi (modificazioni bialleliche, che rendono le cellule CCR5-/-, non ne hanno trovate).
Poca roba davvero, se confrontata alle ZFN.
Perché, allora, i ricercatori di Yale dicono che il loro metodo è migliore di quello di Sangamo? Perché sono andati a controllare gli effetti “off-target”, in particolare sul CCR2, che è il gene più “simile” al CCR5 ed è dunque quello più facilmente modificato quando si sbaglia bersaglio, e praticamente non ne hanno trovati (0,057%): la frequenza degli “off-target” è stata di 43 volte più bassa rispetto alla frequenza di modificazione del CCR5 (2,46%, appunto).
Usando le ZFN, invece, June e Sangamo (Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases) avevano mostrato una frequenza di “off-target” del 5,39%, a fronte di una frequenza del 35,6% di modificazioni del CCR5 (quindi solo 6 volte minore).
MA: era il 2008. L’estate scorsa sono usciti due lavori completamente diversi e indipendenti da Sangamo (di cui abbiamo parlato nel thread [STUDI] Sangamo: CD4 e staminali resi CCR5- mediante ZFN) dai quali emerge che gli “off-target” causati dalle nucleasi a dita di zinco sono molto, ma molto di meno. Stando a quanto dichiarato da Gregory in occasione della pubblicazione di quei lavori, con le concentrazioni usate da Sangamo si rischia di sbagliare bersaglio 1 volta su 20.000, quindi la frequenza crolla a 0,00005. Trascurabile, credo.
Se le cose stanno davvero così, mi pare che venga a cadere una delle principali ragioni per preferire i PNA alle ZFN.

Tralascio gli esperimenti fatti da Schleifman e Glaser per infettare con l’HIV le cellule modificate, perché hanno ottenuto il risultato che già conosciamo: se si distrugge il CCR5, le cellule diventano resistenti all’HIV.

Passo alla questione staminali, perché qui ci sono due particolari che mi lasciano più che perplessa.
Schleifman e Glaser hanno, come detto, modificato geneticamente anche delle staminali ematopoietiche umane. Ma la loro premessa è la seguente:

  • “in caso di applicazione clinica, la modificazione ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche di pazienti con HIV-1 potrebbe fornire un metodo per creare una fonte rinnovabile di cellule immunitarie resistenti al virus. Da notare che è stato dimostrato che le CD34+ umane rimangono non infettate anche in pazienti infetti da HIV-1 [Importantly, human CD34+ HSCs have been shown to remain uninfected even in HIV-1-infected patients].”

A parte l'incongruità di scrivere che le CD34 rimangono non infettate ANCHE (o *PERFINO*!!) in pazienti HIV+ (di chi altro si sta parlando?!), questi signori citano, a riprova di questa bestialità, un articolo di Shen e altri del 1999: Intrinsic Human Immunodeficiency Virus Type 1 Resistance of Hematopoietic Stem Cells Despite Coreceptor Expression, in cui si *dimostra* che le staminali sono un “santuario” resistente all’HIV. Mai sentito parlare di Kathleen Collins?! Il mondo è andato avanti negli ultimi dieci anni, ma a Yale non se ne sono accorti?!

Non è ancora finita: hanno modificato delle staminali con i loro bravi acidi peptidonucleici, le hanno trapiantate in topi umanizzati, hanno visto che attecchivano e … si sono fermati lì!
Perché non hanno provato a infettare i topi?
Eppure la Collins non l’hanno letta, ma la Cannon sì, perché la citano in bibliografia. Ci voleva molto, una volta che i topi erano lì vivi e vegeti e con le staminali funzionanti a inoculargli il virus e a vedere come si comportava il sistema immunitario CCR5-?
MISTERO!

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L’altra ricerca uscita da questo gruppo di lavoro riguarda la sostituzione dei vettori virali con nanoparticelle di PLGA (acido polilattico-coglicolico), un copolimero derivato dall’acido glicolico, che ha l’utile proprietà di essere biodegradabile: usare il PGLA invece di un virus per trasportare le sostanze che devono modificare un gene in una cellula potrebbe consentire di evitare quei rischi di mutagenesi di cui abbiamo parlato tante volte.
E' la prima volta che il PLGA viene usato per trasportare i PNA all'interno delle cellule, ma questo acido è già in uso come vettore di farmaci negli esseri umani, per esempio viene usato per trasportare chemioterapici nella cura del cancro alla prostata.
In questo lavoro, il PLGA è stato usato per modificare delle staminali/progenitrici ematopoietiche umane mediante PNA e ha dimostrato una bassa tossicità. Il prossimo passo sarà il trapianto di staminali modificate in questo modo in modelli animali per vedere se attecchiscono.

Siamo agli inizi, ma le nanoparticelle stanno diventando di gran moda: per esempio, noi ne abbiamo parlato la primavera scorsa, perché si sta pensando di usare nanoparticelle lipidiche (quindi biodegradabili) per veicolare la briostatina in funzione di eradicazione ([STUDI] La briostatina, candidata per “risvegliare” l’HIV).



Leon
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Re: [STUDI] Cannon: trapianto staminali umane rese CCR5- in

Messaggio da Leon » mercoledì 12 ottobre 2011, 23:56

Grazie, Dora, per questo bellissimo e illuminantissimo resoconto, che mi ha chiarito le idee su tutti i vari topi e topetti di cui si legge di qua e di là (la Cannon invece non l'ho ancora sentita perché devo trovare un'oretta di "tempo mentale", mentre la lotta alle streghe me ne prende veramente tanto - ma alla fine bruceranno)! Immagine
Dora ha scritto:una recensione scritta da Vincent Kapoulos per il sito di Lafeuillade (The Last Stop Before Starting Eradication Trials in Humans).
Chiedo MOLTO SERENAMENTE: quale sarebbe questo (last) STOP? :evil: :evil: :evil:
Questi modelli di topi umanizzati, che hanno il vantaggio di poter essere infettati con HIV e non con dei virus surrogati, hanno però delle limitazioni, in particolare la vita più breve rispetto a quella sia dei primati sia degli uomini.
E' il loro unico ma enorme difetto (dei topi in generale, intendo): io a un certo punto non ne ho più voluti perché ogni volta che me ne moriva uno mi si spezzava il cuore (chi non ha mai convissuto con queste creaturine straordinarie non può capire, così come non può accettare il DATO DI FATTO che il topo, tra le varie cose, è AUTOIRONICO, qualità che si continua a voler credere appannaggio di un'esigua minoranza di esseri umani).
Per generare topi umanizzati con CD34+ trapiantate, i topi subiscono un pre-condizionamento (mediante raggi gamma o busulfano) per creare una nicchia nel midollo, che possa accogliere le progenitrici ematopoietiche umane CD34+
Vedi che 'sta cosa dello "spazio", cui abbiamo accennato più volte, è vera?!
Immagine [Per me, questa donna è fantastica!]
Infatti lo è ("Ich bin ein Berliner" - ma LOL! :lol: ), tranne che, se non le slegano le mani, poco conta (io temo proprio che si sia mossa male dal punto di vista "burocratico" e rimango abbastanza convinto che se Hütter si fosse mosso come lei, a quest'ora il paziente tedesco non ci sarebbe, con grandissima gioia di molti ma non mia).



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Re: [STUDI]Cannon_trapianto staminali umane rese CCR5- in to

Messaggio da Dora » giovedì 13 ottobre 2011, 2:18

Leon ha scritto:la Cannon invece non l'ho ancora sentita perché devo trovare un'oretta di "tempo mentale", mentre la lotta alle streghe me ne prende veramente tanto - ma alla fine bruceranno! Immagine
Immagine ;)
Dora ha scritto:Questi modelli di topi umanizzati, che hanno il vantaggio di poter essere infettati con HIV e non con dei virus surrogati, hanno però delle limitazioni, in particolare la vita più breve rispetto a quella sia dei primati sia degli uomini.
E' il loro unico ma enorme difetto (dei topi in generale, intendo): io a un certo punto non ne ho più voluti perché ogni volta che me ne moriva uno mi si spezzava il cuore (chi non ha mai convissuto con queste creaturine straordinarie non può capire, così come non può accettare il DATO DI FATTO che il topo, tra le varie cose, è AUTOIRONICO, qualità che si continua a voler credere appannaggio di un'esigua minoranza di esseri umani).
Come ben sai, non potrei essere più d'accordo!
Credo che abbiano grandi lezioni di autoironia da darci e che ci rispecchino infinitamente meglio delle orride scimmiacce.

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P.S. Leon, senza fretta perché la lotta contro le streghe ha la precedenza assoluta, ma mi piacerebbe tanto se dessi un'occhiata al mio ultimo post, perché i pasticci che io ho visto nel lavoro di quei tipi di Yale mi sembrano così grossi da farmi pensare che devo avere sbagliato tutto io. Grazie! Immagine



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Re: [STUDI]Cannon_trapianto staminali umane rese CCR5- in to

Messaggio da thelondonsuede » giovedì 13 ottobre 2011, 14:51

dora meh se a natale ti regalo il piccolo alchimista e prendo in campagna 3 pantegane lo fai teh sto vaccino che facciamo prima :lol: :lol: :lol:



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Re: [STUDI]Cannon_trapianto staminali umane rese CCR5- in to

Messaggio da Dora » giovedì 13 ottobre 2011, 20:21

thelondonsuede ha scritto:dora meh se a natale ti regalo il piccolo alchimista e prendo in campagna 3 pantegane lo fai teh sto vaccino che facciamo prima :lol: :lol: :lol:
Ma è un'idea geniale, London!!!
Potremmo addirittura brevettare uno yogurt alla pantegana e venderlo come mirabolante pozione eradicante.



P.S. Per le pantegane non c'è bisogno che ti disturbi: il cortile di Uffa ne è pieno. :lol: :lol: :lol:



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Re: [STUDI]Cannon_trapianto staminali umane rese CCR5- in to

Messaggio da HLAB5701 » giovedì 13 ottobre 2011, 20:53

Dora ha scritto: P.S. Per le pantegane non c'è bisogno che ti disturbi: il cortile di Uffa ne è pieno. :lol: :lol: :lol:
non solo il suo :evil: :evil:



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Re: [STUDI]Cannon_trapianto staminali umane rese CCR5- in to

Messaggio da thelondonsuede » giovedì 13 ottobre 2011, 21:10

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:lol: :lol: 8-)



Dora
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Re: [STUDI]Cannon_trapianto staminali umane rese CCR5- in to

Messaggio da Dora » mercoledì 14 dicembre 2011, 6:00

Questo è l'abstract della presentazione di Paula Cannon a St Martin. Mi par di capire che sia ancora ben lontana dal poter iniziare la sperimentazione clinica.
Siamo ancora agli "optimization efforts", alle "wish-lists" e ai "future improvements"! E ancora - e chissà per quanto! - ai topi ...
:?


Abstract 44
CCR5 Knock-out in Hematopoietic Stem Cells

P Cannon
University of Southern California


The non-essential CCR5 co-receptor provides a unique opportunity to exploit gene knockout technologies for anti-HIV therapy. Autologous cells from HIV+ individuals modified to be CCR5-negative could suppress the replication of R5-tropic HIV and thereby affect a functional cure. CCR5-targeted nucleases are available in both the ZFN and TALEN platforms, and produce permanently CCR5-negative cells following only transient expression.
Both mature T cells and hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) are suitable target populations.

Research in our lab is focused on the modification of HSPC. Optimization efforts are underway to maximize the efficiency of CCR5 gene disruption while minimizing any adverse effects on cell viability or hematopoietic potential.
These parameters can be evaluated using humanized mouse models, since human HSPC engraftment of these animals supports the development of multiple lineages, including CD4+ T cells, and long-term HIV infections can be established.
Initial studies using ZFN-treated cord blood HSPC provided proof-of-principle of the anti-HIV effect of CCR5 knockout. More recently, we have been performing larger scale pre-clinical studies using HSPC isolated from mobilized peripheral blood, which is the target clinical cell product. My talk will describe the use of these reagents in HSPC, the current capabilities of this approach, and the wish-list for future improvements.



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