CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integrato

Ricerca scientifica finalizzata all'eradicazione o al controllo dell'infezione.
Blast
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Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Blast » martedì 29 novembre 2016, 23:08

Beh ma dicendo che questa è la ricerca più promettente, contrapponendola agli anticorpi monoclonali (definiti inutili da seguire), hai lasciato intendere che sia la ricerca che lascia più speranze, e invece il buon senso ci suggerisce che questo tipo di approccio difficilmente porterà ad una cura definitiva (sicuramente non a breve/medio termine e non con questo unico studio). Sorvolo ovviamente sull' "inutile" degli anticorpi monoclonali, mi piace pensare che tu l'abbia scritta in modo ironico


CIAO GIOIE

Keanu
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Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Keanu » mercoledì 30 novembre 2016, 17:11

Sono pareri. Non mi serve un anticorpo che mi duri qualche mese per poi essere punto e capo, mi serve un anticorpo che duri tutta la vita, che mi renda immune alla malattia al 100% o, meglio ancora, qualcosa che mi levi l'HIV dal corpo per sempre.



Blast
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Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Blast » mercoledì 30 novembre 2016, 19:04

Che è quello che vogliamo tutti. Poi, quando si torna con i piedi per terra e si riesce ad essere un po' più razionali, si comincia a discutere dei vari approcci per strategie di cura che verosimilmente possano portare a breve ad avvicinarsi alla cura definitiva.


CIAO GIOIE

Keanu
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Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Keanu » giovedì 1 dicembre 2016, 19:34

Vai 1000 km oltre quello che uno vuole dire. Ma che vuol dire quest'ultima uscita? Discorso chiuso.



Blast
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Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Blast » venerdì 2 dicembre 2016, 13:37

Guarda, trovo davvero fastidioso definire "inutile" una ricerca (che tra l'altro è invece molto promettente). Quindi se non vuoi risposte come la mia, vedi di ponderare l'utilizzo di certe parole, specialmente in questa sezione


CIAO GIOIE

Dora
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Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Dora » martedì 2 maggio 2017, 7:19

Maggio 2016
Dora ha scritto:Immagine

KAMEL KHALILI: DISTRUZIONE DEL DNA DELL'HIV-1 NELLA PRIMA FASE DELLE SPERIMENTAZIONI IN VIVO IN TOPI E RATTI


L'altro ieri Kamel Khalili e colleghi della Temple University hanno pubblicato su Gene Therapy (Nature) un articolo che segna l'inizio della sperimentazione delle CRISPR/Cas9 in vivo per distruggere l'HIV integrato nel genoma delle cellule.
  • 1. Hanno lavorato su topi e ratti transgenici, i quali erano stati progettati in modo da incorporare i geni di HIV in ogni cellula del loro corpo.
    2. Hanno unito una versione corta della endonucleasi Cas9 (saCas9) a molteplici RNA guida (gRNAs) costruendo il complesso saCas9/gRNA in modo da colpire le sequenze del DNA virale comprese fra il 5'-LTR e il gene Gag, così da distruggere parti del DNA di cui HIV non può fare a meno per replicarsi.
    3. Hanno fatto esprimere il complesso saCas9/gRNA da un Adeno-associato virus 9 ricombinante (rAAV9), utilizzato come vettore.
    4. Hanno iniettato il rAAV:saCas9/gRNA nella coda dei topi perché si diffondesse attraverso il circolo sanguigno e hanno aspettato due settimane.
    5. Dopo due settimane, hanno raccolto campioni di diversi tessuti e ne hanno analizzato il DNA.
    6. Hanno potuto osservare che i segmenti di HIV DNA contro cui si dovevano dirigere le CRISPR erano stati distrutti in ogni tessuto, compresi cervello, cuore, reni, fegato, polmoni, milza, linfonodi e cellule del sangue.
    7. Le analisi dell'RNA virale nei ratti hanno mostrato una significativa diminuzione dell'HIV RNA nei linfociti circolanti nel sangue e nei linfonodi, a indicare che la distruzione del genoma virale aveva avuto un impatto sull'espressione dei geni di HIV nelle cellule che ospitavano il DNA provirale integrato.
Questo naturalmente fa ipotizzare a Khalili che il sistema di trasporto delle CRISPR utilizzato per la prima volta per distruggere in vivo il DNA di HIV, il rAAV, possa permettere di distruggere ampi frammenti di DNA virale e quindi diminuire di molto, o addirittura rendere nulla, la possibilità che si sviluppi del virus capace di replicazione o che si verifichino mutazioni di escape.

Il prossimo passo sarà quello di
  • - sperimentare su gruppi di animali più ampi;
    - monitorare per periodi più lunghi gli effetti e la sicurezza del trattamento;
    - capire il dosaggio ideale di saCas9/gRNA da somministrare.
[...]

FONTI:
Maggio 2017

Immagine

KAMEL KHALILI e WENHUI HU: DISTRUZIONE DEL DNA DELL'HIV-1 NELLA SECONDA FASE DELLE SPERIMENTAZIONI IN VIVO IN TRE DIVERSI MODELLI DI TOPI

Esce su Molecular Therapy (cioè Science) la continuazione del lavoro dei ricercatori della Temple University sull'escissione in vivo del provirus di HIV dalle cellule di tre diversi modelli di topi.
Oltre al modello usato l'anno scorso in cui sono stati replicati i risultati già visti (escissione dei geni di HIV dal 60-95% delle cellule infette), la distruzione del DNA virale integrato nel genoma delle cellule mediante CRISPR/Cas9 è stata operata anche su un modello di topi "normali" (non umanizzati) che rappresenta l'infezione acuta con un virus chiamato EcoHIV, che è l'equivalente murino dell'HIV-1 che infetta gli uomini, e poi su un modello di topi umanizzati che riepiloga l'infezione cronica o latente.

Nel caso dell'EcoHIV dei topi si è studiata la capacità delle CRISPR somministrate immediatamente dopo l'inoculazione del virus di bloccare la replicazione virale attiva e di impedire che l'infezione da localizzata nel sito dove è avvenuto il contagio diventi sistemica. Qui si è raggiunta un'efficienza nella distruzione del DNA provirale molto alta, addirittura del 96% (mentre nei topi di controllo l'infezione è rapidamente divenuta sistemica). Questo fa dire ai ricercatori che le CRISPR potrebbero essere usate in funzione preventiva (come una sorta di PrEP - dicono), in sostanza per impedire che l'infezione acuta da localizzata al sito del contagio si espanda e si generalizzi.

Nel terzo tipo di esperimenti, l'infezione latente è stata riprodotta trapiantando nei topi umanizzati cellule del sistema immunitario umano e fra queste linfociti T latentemente infettati da HIV-1. È stato utilizzato un classico modello di topi transgenici chiamato BLT (bone marrow, liver, thymus) e i topi sono stati infettati sia per via vaginale, sia per iniezione intraperitoneale, con un HIV-1 che è sia R5-, sia macrofago-tropico.
Un singolo trattamento con CRISPR/Cas9 ha permesso di distruggere porzioni del genoma di HIV dalle cellule umane latentemente infette che si erano localizzate nei tessuti e negli organi dei topi. Qui però le cose sono state complicate dal fatto che il sistema immunitario di questi topini è incompleto, quindi se all'inizio si è visto un certo grado di disseminazione del virus sia locale, sia sistemica, e dopo un paio di mesi di virus non se ne vedeva più, è difficile dire se la sparizione del virus sia da attribuire alla deplezione dei linfociti T, alla latenza di HIV o a mutazioni del virus che l'abbiano reso incapace di trascriversi.
In ogni caso, sono state individuate delezioni in frammenti dei genomi virali che sono stati raccolti dai tessuti e che fanno pensare che le CRISPR abbiano fatto quel che dovevano, distruggendo in modo efficace il virus integrato nel genoma delle cellule latentemente infette.

Dal momento che il trasporto in vivo delle CRISPR resta uno dei principali problemi di questa tecnologia, rispetto alla ricerca dell'anno scorso, Khalili e colleghi hanno modificato il vettore con cui le CRISPR sono trasportate fino alle cellule che devono colpire: hanno infatti utilizzato un vettore virale formato da un adenovirus ricombinante chiamato AAV-DJ/8.
Inoltre, grazie al fatto che le proteine Cas9 sono molto piccole e se ne possono caricare più d'una sul medesimo vettore, hanno aumentato gli RNA guida, facendone trasportare 4 dal vettore derivate dallo Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) dell'anno scorso, in modo da riuscire a colpire una maggiore varietà di cellule e da evitare il più possibile che HIV sviluppasse mutazioni di escape, che gli permettessero di sfuggire all'azione delle CRISPR/Cas9.

Ultima innovazione: i livelli di HIV RNA sono stati misurati mediante un sistema di immagini a bioluminescenza sviluppato all'università di Pittsburg, che consente di individuare la localizzazione spaziale e temporale delle cellule infette nel corpo, osservando la replicazione di HIV in tempo reale e riuscendo a localizzare i reservoir latenti nei tessuti (cfr. il post ImmunoPET per LOCALIZZARE DOVE NEL CORPO AVVIENE LA REPLICAZIONE DI SIV/HIV).

Immagine

Le conclusioni che Khalili e colleghi traggono da questo lavoro sono che il nuovo sistema di trasporto delle CRISPR ha funzionato bene e, anche in base a quanto si sta vedendo in tanti altri studi, dovrebbe permettere di ridurre in modo radicale i rischi di mutagenesi, di tossicità e di aggressiva risposta immune da parte dell'ospite che sono connessi a ogni terapia genica. Ritengono che i vettori diverranno nel tempo sempre migliori, così da potersi rivolgere verso cellule diverse, dai CD4 latentemente infetti ai monociti-macrofagi, alle staminali.
L'uso di diversi RNA guida, poi, ha reso più efficace l'azione di distruzione del DNA provirale, permettendo di colpire diversi obiettivi contemporaneamente e limitando la creazione di mutazioni di escape.

Gli studi fatti finora offrono una base per portare questo approccio verso lo sviluppo clinico. Poiché però l'indice farmacologico - cioè la dose di CRISPR/Cas9 da somministrare per ottenere il maggiore effetto terapeutico con la minor tossicità e i minori effetti collaterali - non è noto, è necessario valutarlo in un modello animale che sia più rilevante del topo da un punto di vista clinico. I primati non umani infettati da SIV, ad esempio.

Il prossimo passo sarà dunque quello di tentare di eradicare SIV dalle scimmie. I trial clinici sull'uomo sono prevedibilmente "in the near future" (Khalili ha finalmente imparato a non sbilanciarsi troppo sui tempi ed evita sparate ad effetto come quelle dei suoi primi lavori).




FONTI:



skydrake
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Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da skydrake » martedì 2 maggio 2017, 7:33

Ultimamente vedo questo CRISPR ovunque. Anche non applicato in medicina:
http://www.lescienze.it/news/2017/04/26 ... e-3503511/

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Dora
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Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Dora » martedì 2 maggio 2017, 7:35

skydrake ha scritto:Ultimamente vedo questo CRISPR ovunque. Anche non applicato in medicina:
http://www.lescienze.it/news/2017/04/26 ... e-3503511/
Ovvio che la discussione su questa tecnologia sia enorme, visto che è una delle cose più importanti ed eccitanti sviluppate in questi anni. Ma che c'entra questo con i topi di Khalili?



Gabriel81
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Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Gabriel81 » martedì 2 maggio 2017, 7:49

Non vorrei essere troppo ottimista, ma mi sembra ad oggi quanto di più vicino a livello sperimentale ad una cura funzionale o addirittura eradicativa..vediamo sulle scimmie come prosegue!
Dora ma utilizzare come vettore un retrovirus stesso invece non è possibile perché va in conflitto con il principio stesso alla base della sperimentazione?


Una pianificazione attenta non sostituirà mai una bella botta di culo!

Dora
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Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Dora » martedì 2 maggio 2017, 8:00

Gabriel81 ha scritto:Dora ma utilizzare come vettore un retrovirus stesso invece non è possibile perché va in conflitto con il principio stesso alla base della sperimentazione?
Un retrovirus si integra in modo permanente nel genoma e poi non sai che danni immani potrebbe combinare. Il nostro genoma è pieno di retrovirus fossili, ma si sono integrati migliaia e migliaia di anni fa e oggi non causano più danni, anzi in certi casi danno contributi preziosi come la formazione della placenta (in certi altri casi, però, si teme che agendo sulla trascrizione dei geni qualche robaccia cattiva si risvegli e questa è una delle preoccupazioni che erano sorte quando si sono cominciate ad usare sostanze anti-latenza come gli inibitori della iston-deacetilasi, che agiscono sul rimodellamento della cromatina - una preoccupazione eccessiva, come si è visto).
Quello che si cerca come vettore è piuttosto qualcosa che arrivi alle cellule, depositi il suo prezioso carico e si autodissolva, o comunque sparisca nel più breve tempo possibile, assolutamente senza integrarsi.



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