CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integrato

Ricerca scientifica finalizzata all'eradicazione o al controllo dell'infezione.
Dora
Messaggi: 7491
Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48

Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Dora » martedì 22 maggio 2018, 13:43

Gabriel81 ha scritto:il lentivirus permette l’ingresso in tutte le cellule Tcd4 (latentemente infette e non) e le guide del cas9 si “attiverebbero” solo in presenza di provirus integrato nel genoma con sequenze REV e TAT riconosciute (e da qui il tema della selezione delle mutazioni di escape), quindi la vera difficoltà è nella costruzione delle guide “efficaci” che includano peri quanto piu conservative è possibile? Il Lentivirus utilizzato teoricamente penetra solo cd4 o potenzialmente anche le altre cellule coinvolte dall’infezione (tipo quei discutibili <edit automatico> dei macrofagi?) dall’articolo non sono riuscito a capire come fosse costruito?
Io credo che questo sia tutto molto teorico, dal momento che quando in vivo si riesce a modificare una quota attorno al 15% delle cellule bersaglio già si lanciano grida di giubilo. Inoltre, qui hanno lavorato solo sul reservoir più esteso, quello dei CD4. E soprattutto: la difficoltà di editare cellule in vivo non è neppure lontanamente paragonabile con quella di modificare cellule in coltura.
La costruzione del vettore va al di là delle mie forze! In ogni caso, la trovi al paragrafo Lentiviral vector construction and transduction dei Methods.
Secondo te, se teoricamente dal paziente estraessi prima HIV-DNA integrato, chissà se si possa costruire le guide in maniera paziente specifica?(chiaro che sarebbe troppo costoso per farlo a tutti, ma pensavo per l’impostazione del trial)
Immagino di sì, ma il provirus archiviato nel reservoir non è necessariamente omogeneo, anche se poi una volta lì resta senza trascriversi. Quindi quello della personalizzazione degli RNA guida mi pare un lavoro davvero enorme, che per altro mi sembra possa essere evitato da un approccio come questo dei ricercatori della Kobe University, che hanno cercato di costruire i gRNA in modo da comprendere la maggior parte dei sottotipi di HIV-1.
Potenzialmente sarebbe estendibile anche per una cura eradicante oltre che funzionale?
Per adesso ne dubito, perché il presupposto sarebbe di trovare tutte le cellule latentemente infette e distruggere tutti i provirus.



Dora
Messaggi: 7491
Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48

Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Dora » martedì 17 luglio 2018, 8:25

La storia infinita dei possibili danni non intenzionali che le CRISPR possono indurre nel genoma vede oggi un nuovo capitolo, con la pubblicazione su Nature Biotechnology di Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements, un lavoro di genetisti del britannico Wellcome Sanger Institute, che hanno compiuto una mappatura sistematica del genoma di cellule di topi e di uomini su cui si era intervenuti con editing mediante CRISPR/Cas9 e ritengono che le mutazioni non volute indotte nel DNA siano molte di più di quanto si pensasse (o sperasse).

Per chi volesse capire meglio e si sentisse bloccato davanti ai tecnicismi dell'articolo di Allan Bradley e colleghi, due articoli ripercorrono anche la storia del lavoro della Columbia University che abbiamo seguito fra maggio 2017 e la primavera scorsa:

- su Science Alert, Peter Dockrill: CRISPR Could Be Causing Extensive Mutations And Genetic Damage After All,

- e soprattutto su Stat, Sharon Begley: Potential DNA damage from CRISPR has been ‘seriously underestimated,’ study finds.

I titoli delle aziende attive nel settore hanno subito un immediato tracollo, ad esempio la svizzera CRISPR AG ha perso oggi l’8.6%, Editas Medicine ha perso il 7.5% e Intellia Therapeutics il 9.6% - riferisce GoInPharma.



Gabriel81
Messaggi: 1100
Iscritto il: domenica 26 febbraio 2017, 22:44
Località: Milano

Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integr

Messaggio da Gabriel81 » martedì 17 luglio 2018, 9:50

Dora ha scritto:La storia infinita dei possibili danni non intenzionali che le CRISPR possono indurre nel genoma vede oggi un nuovo capitolo, con la pubblicazione su Nature Biotechnology di Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements, un lavoro di genetisti del britannico Wellcome Sanger Institute, che hanno compiuto una mappatura sistematica del genoma di cellule di topi e di uomini su cui si era intervenuti con editing mediante CRISPR/Cas9 e ritengono che le mutazioni non volute indotte nel DNA siano molte di più di quanto si pensasse (o sperasse).

Per chi volesse capire meglio e si sentisse bloccato davanti ai tecnicismi dell'articolo di Allan Bradley e colleghi, due articoli ripercorrono anche la storia del lavoro della Columbia University che abbiamo seguito fra maggio 2017 e la primavera scorsa:

- su Science Alert, Peter Dockrill: CRISPR Could Be Causing Extensive Mutations And Genetic Damage After All,

- e soprattutto su Stat, Sharon Begley: Potential DNA damage from CRISPR has been ‘seriously underestimated,’ study finds.

I titoli delle aziende attive nel settore hanno subito un immediato tracollo, ad esempio la svizzera CRISPR AG ha perso oggi l’8.6%, Editas Medicine ha perso il 7.5% e Intellia Therapeutics il 9.6% - riferisce GoInPharma.
Diciamo che era prevedibile che potessero verificarsi questo tipo di controbattute (o faide?)...comunque la voglio prendere semplicemente come l'occasione di capire sempre meglio tutti gli aspetti di questo metodo molto affascinante (e sicuramente con molti lati oscuri) e che necessita piuttosto di tantissima ricerca e non di battute d'arresto (spero...)

grazie cara!


Una pianificazione attenta non sostituirà mai una bella botta di culo!

Dora
Messaggi: 7491
Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48

Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integrato

Messaggio da Dora » venerdì 8 marzo 2019, 15:54

#CROI2019 - DISTRUZIONE EX VIVO E IN VIVO DEL GENOMA DI SIV MEDIANTE CRISPR

Dal laboratorio di Kamel Khalili alla Temple University arriva al CROI un notevole avanzamento della ricerca sull'uso di CRISPR per distruggere i geni di HIV/SIV (LTR e Gag) integrati nelle cellule: dai topi siamo passati alle scimmie.
Tricia Burdo ha presentato a Seattle EX VIVO AND IN VIVO EDITING OF THE SIV GENOME IN NONHUMAN PRIMATES BY CRISPR-CAS9 e poiché Gus Cairns ha appena scritto un bel post per AIDSmap, per avere una visione complessiva di questo lavoro vi rimando al suo
‘Molecular scissors’ successfully remove HIV genes from all tissues in infected monkeys.

Due sole slides dalla presentazione di Burdo: 1) l'impostazione della sperimentazione:

Immagine

2) le conclusioni:

Immagine

È chiaro che ci sono dei limiti enormi: un numero minuscolo di scimmie, solo 4 trattate e 1 di controllo; analisi con il VOA ancora da completare; il fatto che, se da un lato è stato necessario uccidere le scimmie per poter analizzare tutti i loro tessuti, dall'altro non si è potuto provare a sospendere la cART e vedere se c'era rebound delle viremie. Detto tutto questo, però, di cellule sono riusciti a modificarne tante e di virus funzionante non sono riusciti a recuperarne. A me pare un gran bel risultato.



scorpion88
Messaggi: 5
Iscritto il: giovedì 30 maggio 2019, 20:00

Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integrato

Messaggio da scorpion88 » martedì 2 luglio 2019, 19:47

Non so sei sia la solita notizia ma fa ben sperarehttp://www.ansa.it/canale_saluteebenessere/not ... 9312e.html



Semola
Messaggi: 161
Iscritto il: venerdì 16 giugno 2017, 20:50
Località: Milano

Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integrato

Messaggio da Semola » martedì 2 luglio 2019, 20:52

scorpion88 ha scritto:
martedì 2 luglio 2019, 19:47
Non so sei sia la solita notizia ma fa ben sperarehttp://www.ansa.it/canale_saluteebenessere/not ... 9312e.html
Lavoro interessante... peccato per il modello di topo umanizzato che è poco rappresentativo della complessità di tutti i vari componenti del sistema immunitario umano. Dovrebbero testare l'approccio nelle scimmie per avere più confidenza nell'applicabilità nell'uomo. Altro limite è l'utilizzo di AAV9 per il CRISPR-Cas9.

Alla fine su 7 topi trattati con LASER ART e CRISPR-Cas9 solo due hanno dimostrato viremia soppressa e l'analisi si ferma ad un periodo d'osservazione molto breve dal trattamento (5 giorni)...

Dobbiamo fare meglio di così :mrgreen:



Dora
Messaggi: 7491
Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48

Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integrato

Messaggio da Dora » martedì 2 luglio 2019, 21:08

Semola ha scritto:
martedì 2 luglio 2019, 20:52
scorpion88 ha scritto:
martedì 2 luglio 2019, 19:47
Non so sei sia la solita notizia ma fa ben sperarehttp://www.ansa.it/canale_saluteebenessere/not ... 9312e.html
Lavoro interessante... peccato per il modello di topo umanizzato che è poco rappresentativo della complessità di tutti i vari componenti del sistema immunitario umano. Dovrebbero testare l'approccio nelle scimmie per avere più confidenza nell'applicabilità nell'uomo. Altro limite è l'utilizzo di AAV9 per il CRISPR-Cas9.

Alla fine su 7 topi trattati con LASER ART e CRISPR-Cas9 solo due hanno dimostrato viremia soppressa e l'analisi si ferma ad un periodo d'osservazione molto breve dal trattamento (5 giorni)...

Dobbiamo fare meglio di così :mrgreen:
Sono del tutto d'accordo con te. Aggiungo solo che, come al solito, Khalili è bravissimo a vendere il suo prodotto la sua ricerca, creando ad arte un hype insopportabile e del tutto fuori luogo.
Ho visto un fiorire di titoli che vedono la cura in un anno. E parliamo di topi, anzi di neanche la metà di un minuscolo campione di topi.



Semola
Messaggi: 161
Iscritto il: venerdì 16 giugno 2017, 20:50
Località: Milano

Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integrato

Messaggio da Semola » martedì 2 luglio 2019, 22:49

Ah dimenticavo sempre riguardo all'argomento del thread... la brutta notizia riportata da Nature medicine:

"The hidden cost of genetic resistance to HIV-1"
https://www.nature.com/articles/s41591-019-0481-8

In uno studio inglese in 400.000 soggetti hanno riscontrato che i portatori omozigoti di CCR5-Δ32 hanno una mortalità maggiore del 20% in età avanzata. Gli autorì suggeriscono che la delezione CCR5-Δ32 porti ad un aumento del rischio di complicanze in seguito ad episodi influenzali...

Protetti da HIV ma più soggetti a complicazioni fatali dell'influenza: dovremmo mettere sulla bilancia queste considerazioni quando pensiamo di curare l'HIV mediante utilizzo di ematopoietiche o CD4 ingenerizzati per avere CCR5-Δ32? Ai posteri l'ardua sentenza... :ugeek:



Dora
Messaggi: 7491
Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48

Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integrato

Messaggio da Dora » giovedì 12 settembre 2019, 7:19

Immagine


"Il genio è fuori dalla lampada": trapianto di cellule staminali editate con CRISPR/Cas9 in una persona con infezione da HIV e leucemia linfocitica acuta


Ieri, sullo stesso New England Journal of Medicine in cui dieci anni fa vide la luce il primo report di Gero Hütter sul Berlin Patient, un gruppo di ricerca della Peking University di Pechino ha pubblicato un caso clinico di grande interesse, perché vi si riferisce della prima volta che una persona con HIV ha ricevuto un trapianto di cellule staminali modificate mediante CRISPR in modo da renderle CCR5 negative.

Un uomo di 27 anni che, nel maggio 2016, ha ricevuto insieme le diagnosi di HIV e di leucemia linfoblastica acuta, alla diagnosi aveva una viremia di 8 milioni e mezzo (con virus esclusivamente CCR5-tropico) e poco più di 500 CD4.
È stato messo immediatamente in terapia antiretrovirale (lamivudina, tenofovir, lopinavir/ritonavir) e questo ha portato in un anno al controllo della viremia. Contestualmente, ha ricevuto 6 corsi di chemioterapia standard, che hanno portato a una completa remissione della leucemia. A un anno dall'inizio dei trattamenti, i suoi CD4 erano 200.

Nel luglio 2017, dopo un regime di condizionamento completo che ha distrutto il suo midollo (ciclofosfamide + total body irradiation), è stato sottoposto a un trapianto allogenico di staminali, ricevute da una donatrice di 33 anni risultata perfettamente compatibile.
Quello che ha reso questo trapianto speciale è l'editing genetico mediante CRISPR delle cellule staminali e progenitrici (CD34+) della donatrice: delle cellule trapiantate, circa il 18% portava la modificazione del gene ccr5, che codifica per la proteina CCR5 - uno dei due recettori molecolari di cui HIV ha bisogno per infettare una cellula.

Durante il trapianto, la cART è stata modificata sostituendo il raltegravir al lopinavir/r per evitare interazioni con la ciclosporina, uno dei farmaci che sono stati somministrati per evitare il rigetto delle staminali estranee. Come profilassi contro la Graft vs Host, alla ciclosporina sono stati aggiunti metotrexate, basiliximab e micofenolato mofetil. E poi glucocorticoidi e tacrolimus - insomma, un regime deluxe e pesantissimo. Nonostante questo, il paziente ha avuto un episodio di Graft acuta (leggero, di grado 1, e localizzato alla pelle).

Dopo un crollo atteso di neutrofili e piastrine, questi valori in 6 mesi si sono ripresi.
A un mese dal trapianto si è raggiunto un chimerismo completo, che si manteneva ancora a 19 mesi - questo significa che le staminali della donatrice hanno completamente rimpiazzato il sistema immunitario del ricevente.
Sempre a un mese dal trapianto, la leucemia era in remissione completa - e tale è rimasta fino ad oggi.

A 7 mesi dal trapianto, con CD4 attestati su valori di sicurezza, è stata sospesa la cART.

Immagine

Che cosa è successo con l'HIV? Niente, perché le staminali che hanno generato un sistema immunitario resistente al virus erano troppo poche: circa la metà di quel 18% di staminali crisprizzate sono morte durante il trapianto e il 5-8% di quelle rimaste non è stato sufficiente ad eradicare il virus, che infatti ha avuto un rebound nei tempi canonici.

E tuttavia. Tuttavia questo esperimento può essere considerato un successo. Vediamo per quali ragioni.
Anzitutto, perché le staminali modificate sono risultate sane, non si sono evidenziati effetti off target dell'editing, o delezioni o riarrangiamenti strani dei cromosomi, ed è stata creata una progenie di CD4 sani e resistenti al virus, che ancora erano in circolazione a più di un anno e mezzo dal trapianto e presumibilmente continueranno ad essere prodotti in tutti gli anni a venire.
In secondo luogo, perché non è emerso un virus X4-tropico dopo la sospensione della cART.
In terzo luogo, perché non si sono nel frattempo create resistenze e il paziente ha rapidamente recuperato lo stato di viremia irrilevabile quando ha ripreso gli antiretrovirali.

In un editoriale che accompagna la pubblicazione dell'articolo, Carl June si chiede che cosa ci insegni questo caso clinico.
Ci insegna

- che il profilo di sicurezza della modificazione delle staminali mediante CRISPR è accettabile
- che le staminali modificate non sembrano aver avuto effetti immunogenici in questo paziente - ed è importante, perche le nucleasi Cas9 usate in questo studio vengono dallo Streptococcus pyogenes, che è ovunque, e quindi molte persone risultano immuni a Cas9, destinando al fallimento l'editing prima ancora che ci si provi
- che l'assenza di effetti off target rilevati è molto rincuorante
- che forse in Cina il sistema regolatorio è un po' più lasco che negli Stati Uniti, perché questo gruppo di ricerca (che ha senz'altro lavorato benissimo), è potuto passare dai topi all'uomo in soli due anni. Invece lui, alla UPenn, di anni ne ha aspettati 5 prima di poter modificare i CD4 con le ZFN.

Certo, un caso clinico non fa scienza. Ma c'è in corso un trial clinico, quindi presto le persone aumenteranno.
Certo, bisogna risolvere il problema del troppo basso numero di cellule editate. Ma ormai il genio dell'editing del genoma è fuori dalla lampada ed è solo questione di tempo prima che si veda quel che CRISPR riuscirà a fare nell'uomo contro l'HIV.




Fonti:



ninconanco
Messaggi: 50
Iscritto il: venerdì 16 novembre 2018, 18:57

Re: CRISPR/Cas9: distruggere il gene CCR5 o l’HIV DNA integrato

Messaggio da ninconanco » venerdì 13 settembre 2019, 0:01

Ciao Dora,
Scusami se mi permetto di fare qualche domanda. Ma questo trial clinico riguarda sempre persone hiv con leucemia immagino?
Se non ho capito male questo studio è un passo in avanti rispetto ai casi dei pazienti di Berlino e di Londra perché il donatore questa volta non è immune all hiv come i precedenti e quindi è come se si fosse risolto il problema della difficoltà di trovare donatori immuni all hiv. Se è così mi sembra molto positivo.
Quello che non ho capito però, ammettendo anche che questa tecnica risultasse sicura ed efficace resterebbe applicabile sempre e solo per casi gravi? Oppure credi che la ricerca col tempo potrebbe far diventare questa tecnica meno invasiva di come lo è attualmente è quindi applicabile a tutti i sieropositivi?
Grazie mille delle tue spiegazioni!



Rispondi