[STUDI] Sangamo: CD4 e staminali resi CCR5- mediante ZFN II

[skydrake]

Dora ha seguito tale approccio con decine di post ben documentati. Solo questo thread contiene 22 pagine, scritte quasi tutte da lei.
Tuttavia faccio notare che la terapia alle dita di zinco è molto innovativa e elaborata. In altre parole, è medicina del XXI secolo.
Fino pochi decenni fa la modifica del DNA in cellule adulte era considerata una cosa assolutamente impossibile. Per farti un esempio, anche nel film Blade Runner, lo chiese esplicitamente il replicante al professore:
https://youtu.be/bNUaOIPJgDA
che gli rispose che non era possibile, al che il replicante si arrabbiò e uccise il professore.
Data appunto la complessità e rischiosità (=fare errori di trascrizione del DNA, indurre mutazioni, scatenare tumori) i tempi per questa ricerca sono estremamente lunghi.

PS
Dora ha scritto molto anche sulla terapia sperimentale CRISPS per i pazienti sieropositivi, che anch'essa consiste nel manipolare il DNA di adulti, in una modalità forse anche più avanzata.

[giovane888]

Sì ho visto ma gli aggiornamenti erano rimasti al 2018, mentre le prime infusioni sono iniziate nell’ottobre 2020 e verranno misurati gli effetti per 27 mesi, ovvero fino al 2024.
Quindi, secondo me discuterne era interessante anche perché in due anno qualche progresso è stato fatto e Sangamo è una multinazionale molto importante.

Inoltre è sembrato incredibile trovare su internet il video della persona Carl fox che si fa vedere mentre effettua la prima infusione di cellule modificate.

https://www.wcpo.com/news/our-community ... -to-a-cure

[Dora]

Sì ho visto ma gli aggiornamenti erano rimasti al 2018, mentre le prime infusioni sono iniziate nell’ottobre 2020 e verranno misurati gli effetti per 27 mesi, ovvero fino al 2024.
Quindi, secondo me discuterne era interessante anche perché in due anno qualche progresso è stato fatto e Sangamo è una multinazionale molto importante.

Hai ragione, è una questione molto interessante - e non tanto perché Sangamo sia una multinazionale importante (non lo è), quanto perché finalmente, dopo più di 3 anni dall'annuncio della disponibilità di finanziamenti, il nuovo trial, che è partito un paio d'anni fa, dà qualche notizia di sé.
Vedo che, tra le caratteristiche di inclusione, c'è un livello accettabile di CD4 (> 350) e tra quelle di esclusione ci sono eventi AIDS e nadir < 200, e questo è un peccato per la ragione che spiegherò fra poco.

Inoltre è sembrato incredibile trovare su internet il video della persona Carl fox che si fa vedere mentre effettua la prima infusione di cellule modificate.

https://www.wcpo.com/news/our-community ... -to-a-cure

Questa è una cosa piuttosto comune per le sperimentazioni di terapia genica, anche se meno per HIV per ovvie ragioni di partecipanti che preferiscono restare anonimi. Anche se fortunatamente di persone che escono allo scoperto ce ne sono sempre di più e questo Carl Fox ne è un bell'esempio.

Ricordo che anche a seguito del primo trial dell'SB-728-T, ormai dieci anni fa, qualcuno raccontò della sua partecipazione: si trattava di Matt Sharp, un attivista abbastanza noto negli Stati Uniti, che trasse un grande beneficio dall'infusione di CD4 editati in modo da renderli CCR5 negativi, perché la lunga durata della sua infezione lo aveva messo in condizioni immunologiche assai precarie, con un numero di CD4 molto basso, e la permanenza nel tempo dei CD4 editati e resi resistenti ad HIV gli permise di evitarsi le polmoniti che regolarmente funestavano i suoi inverni e forse anche altre infezioni opportunistiche.
Matt è ancora fra noi dopo 10 anni e questo forse è un segno che la partecipazione a quel trial, allora molto pionieristico, ben più di questo nonostante il nome che si è dato, gli portò bene.

Il caso di Matt Sharp servì a far capire una delle possibili utilità di una terapia genica che modifichi i linfociti T così da renderli resistenti al virus: potrebbe essere un intervento per quegli immunologic non responders (INR), che mantengono CD4 molto bassi pur dopo lunghi periodi di cART e di viremia soppressa e per i quali attualmente ci sono davvero pochi, anzi nulli, aiuti farmacologici.
Sangamo allora non sembrava molto disposta a puntare sugli INR, forse perché puntava al colpo grosso di una cura funzionale (nel 2010-11 pensavano ancora all'eradicazione, in realtà).
Oggi però, dopo l'ultimo lavoro che hanno pubblicato e uno in pre-print, di cui scriverò qualcosa appena possibile, pensavo avessero cambiato idea.

[Dora]

SB-728-T: DUE AGGIORNAMENTI

Vorrei riprendere il thread dedicato all'SB-728-T di Sangamo per dar conto di due articoli.
Il primo è di Tebas, June, Riley ... - i soliti ricercatori della University of Pennsylvania che hanno fatto gran parte delle sperimentazioni, uscito il mese scorso sul Journal of Clinical Investigation:

CCR5-edited CD4 T cells augment HIV-specific immunity to enable post rebound control of HIV replication.

È relativo a un trial di fase I completato un paio d'anni fa e la grande differenza rispetto alle sperimentazioni precedenti è sostanzialmente il tipo vettore con cui le nucleasi a dita di zinco venivano portate nei CD4 per distruggere il gene CCR5, oltre al fatto che il trial era diviso in tre bracci, in uno dei quali non si dava ciclofosfamide come condizionamento pre-infusione, mentre negli altri sì.

Il secondo articolo, di Sekaly e vari altri colleghi fra USA e Canada, è ancora in pre-print, ma poiché i suoi risultati sono stati già presentati a congressi alcuni anni fa immagino che la versione pubblicata non si discosterà molto dal testo messo online su biorXiv. Ne parliamo fra un po'.

Veniamo al lavoro di Tebas e colleghi. Come detto, il trial riguardava il modo di trasportare ex vivo le ZFN dentro le cellule, che nelle sperimentazioni precedenti era un adenovirus (Ad5f35), il cui uso in persone con HIV può essere poco indicato, mentre in questa un RNA messaggero (il prodotto testato si chiama dunque SB-728mR-T). Inoltre, si proponeva di capire se gli eterozigoti CCR5Δ32 (persone che hanno come corredo genetico la delezione Δ32 del gene che codifica per il recettore CCR5 in metà delle loro cellule e sono quindi parzialmente protette dall'infezione da HIV) siano avvantaggiati dall'editing del CCR5 nei CD4 rispetto alle persone con tutti e due i geni funzionanti, come pare essere indicato da trial precedenti fatti da Sangamo, in cui le persone che meglio hanno controllato la viremia dopo l'editing dei CD4 erano appunto eterozigoti CCR5Δ32. Inoltre, si voleva capire se dare ciclofosfamide prima dell'infusione delle cellule modificate, distruggendo almeno parzialmente il comparto dei linfociti T e così creando spazio, serva o no per farle attecchire meglio, se in generale le cellule modificate siano in grado di ritardare il rebound delle viremie una volta sospesa la cART e che tipo di risposte HIV-specifiche di CD4 e CD8 questo tipo di procedura possa causare.

Il trial, in aperto, ha dunque arruolato 14 persone con infezione da HIV ben controllata da un regime di cART stabile, set point virale conosciuto, nadir dei CD4 non inferiore a 200 e livelli dei CD4 al momento dell'arruolamento non inferiori a 450, e le ha divise in tre gruppi: alla prima coorte, di 3 persone, sono stati reinfusi i CD4 modificati senza pre-condizionamento per confermare che l'mRNA usato per editare le cellule era sicuro; alla seconda coorte, composta di persone con CCR5 wild type, e alla terza, composta di eterozigoti CCR5Δ32, prima di re-infondere i CD4 sono stati somministrati un basso o un più alto dosaggio di ciclofosfamide.
Tutti hanno ricevuto una singola infusione di 10 miliardi di cellule editate, tranne un partecipante che ne ha ricevute 6,6 miliardi perché l'espansione ex vivo dei suoi linfociti T è andata un po' meno bene.



La percentuale di cellule effettivamente modificate è risultata simile a quella degli studi fatti in precedenza, compresa fra il 20 e il 30%, e l'infusione dell'SB-728mR-T si è confermata una procedura sicura, senza eventi avversi seri attribuibili all'intervento. Poiché 2 dei partecipanti avevano già partecipato alla sperimentazione originale dell'SB-728-T, si è visto non solo che i CD4 modificati molti anni prima erano ancora in circolazione, ma anche che ripetere la procedura dell'editing più di una volta è possibile senza effetti collaterali di rilievo.



Il protocollo del trial prevedeva una interruzione della cART per indagare se i CD4 modificati erano in grado di ritardare il rebound delle viremie. Poiché in questa sperimentazione non c'era un gruppo di controllo, sono stati usati dei controlli storici simili per caratteristiche demografiche e di infezione, tratti dalla coorte di 4 trial ACTG (AIDS Clinical Trial Group) in cui sono state studiate interruzioni dei trattamenti senza che venissero fatti altri tipi di interventi.



La coorte 1 ha interrotto la cART dopo 8 settimane dall'infusione, le coorti 2 e 3 dopo 4 settimane.
Il risultato sul controllo delle viremie è stato abbastanza deludente: la maggior parte dei partecipanti ha sperimentato il rebound (HIV RNA > 200 copie) entro la quarta settimana e raggiunto il picco della viremia entro l'ottava. Considerando tutti i gruppi insieme, il rebound è stato leggermente differito rispetto ai controlli storici, ma lo studio non aveva abbastanza partecipanti per raggiungere la potenza statistica necessaria per differenziare fra le tre coorti.
Nessuna variazione di rilievo nelle dimensioni prima e dopo il trattamento dei reservoir composti da virus capace di replicazione.

Un aspetto importante da notare è che la ciclofosfamide, a qualsiasi dosaggio, non sembra aver avuto alcun effetto sui tempi di rebound. Questo porta Tebas e colleghi a concludere che ne sconsigliano l'uso nei trial futuri ogni volta che sia necessario promuovere un miglior attecchimento dei linfociti T modificati in persone con HIV. Davvero un peccato che questo articolo esca quando ormai Carl Fox e gli altri partecipanti del trial TRAILBLAZER si sono sottoposti (o si sottoporranno) a una procedura chemioterapica inutile e non senza rischi.



In generale, si è osservato un migliore e più rapido attecchimento dei CD4 modificati nelle persone eterozigoti CCR5Δ32, ma alla fine del periodo di 16 settimane di sospensione della cART non c'erano differenze statisticamente significative tra eterozigoti CCR5Δ32 e wild type.
Anche i tempi di rebound sono stati simili, anche se gli eterozigoti CCR5Δ32 avevano reservoir latenti di dimensioni più ridotte, quindi è difficile dire che la delezione naturale di uno dei due alleli CCR5 sia un elemento che favorisce davvero la procedura.
Quello che però si è visto è che 2 dei 4 eterozigoti CCR5Δ32 (uno ha preso la cART quando era in sospensione terapeutica quindi non fa testo) sono diventati post rebound controllers - cioè dopo il rebound hanno comunque mantenuto un certo controllo delle viremie (il protocollo prevedeva una sospensione di 16 settimane o la ripresa degli antiretrovirali se la viremia superava le 100.000 copie in tre prelievi successivi). Questo è avvenuto solo a 1 dei 9 della coorte di CCR5 wild type e ciò spinge Tebas e colleghi a ipotizzare che se l'editing del CCR5 riuscisse ad essere più efficiente, cosa fattibile con i continui miglioramenti che queste tecniche stanno avendo in questi anni, la differenza fra eterozigoti CCR5Δ32 e wild type si ridurrebbe, rendendo questa procedura più utile per la stragrande maggioranza delle persone con HIV.

L'analisi delle risposte immuni HIV-specifiche ha mostrato che le migliori e più durature risposte dei CD8 si sono avute proprio nelle 3 persone che hanno riacquistato un certo controllo delle viremie dopo il rebound - questo suggerisce che i CD4 modificati e resi più resistenti all'HIV abbiano dato maggior vigore ai CD8, ed è un risultato molto importante nella prospettiva di una cura funzionale.
Non c'è invece stato modo di valutare se le migliori risposte dei CD4 abbiano stimolato anche una migliore risposta anticorpale.

Un lavoro di Riley uscito l'estate scorsa su Molecular Therapy ha dimostrato come la modificazione dei CD4 per renderli in grado di esprimere CAR₄ (un recettore dell'antigene chimera HIV-specifico) li ha resi capaci non solo di espandersi in vivo, ma anche di stimolare la persistenza e l'efficacia sia di CD8 anch'essi resi HIV-specifici mediante CAR, sia di CD8 naturali.



Questo permette a Tebas e colleghi di concludere l'articolo annunciando un nuovo trial clinico della University of Pennsylvania, randomizzato ma in aperto - CD4 CAR+ ZFN-modified T Cells in HIV Therapy - in cui vengono infusi insieme sia fino a 10 miliardi di CD4 trattati con ZFN, sia CD4 e CD8 CAR, HIV-specifici e HIV-resistenti, per vedere se tutte queste risposte messe insieme riescono a contenere la replicazione di HIV in modo consistente e duraturo in 12 partecipanti dalle caratteristiche simili a quelle del trial con SB-728mR-T di cui abbiamo appena parlato (CD4 ≥450, nadir CD4 ≥200, HIV-1 RNA ≤50 da almeno 6 mesi).
La sperimentazione è ancora in fase di reclutamento dei partecipanti e si dovrebbe concludere fra fine di quest'anno e fine 2025.


Mi rendo conto che il post sta diventando troppo lungo, quindi rimando la trattazione del secondo articolo a un prossimo post.

[Mandrake]

Scusa Dora, sono un “semplice” lettore che purtroppo ci capisce poco di tutti questi termini e studi.

Ho letto che riprendevano la terapia se la viremia superava i 100.000 per tre misurazioni consecutive: ma così facendo non si espone ad rischi ben più alti? Il gioco in questo caso vale effettivamente la candela?

Ripeto, è pura curiosità di uno che sa zero. Però quel dato mi ha colpito

[Dora]

Ho letto che riprendevano la terapia se la viremia superava i 100.000 per tre misurazioni consecutive: ma così facendo non si espone ad rischi ben più alti? Il gioco in questo caso vale effettivamente la candela?

Sì, qualche piccolo rischio c'è, ma non è che lasci andare la viremia incontrollata a lungo e i controlli sono molto ravvicinati.
D'altra parte, non ha molto senso fare una interruzione terapeutica per vedere se l'intervento fatto permette qualche controllo della viremia e poi ricominciare subito la cART appena vedi un rebound di 100 copie. Devi avere il tempo di vedere non solo dopo quanti giorni/settimane/mesi si verifica il rebound, ma anche a che livelli si assesta il nuovo set point (cioè fino a dove si alza la viremia, se fino al livello di prima di cominciare la cART, e allora l'intervento che hai fatto è servito a poco, oppure più in basso, e allora qualche risultato l'hai ottenuto).
Se in questa sperimentazione avessero ricominciato la cART appena visto che la viremia tornava rilevabile, ad esempio non avrebbero mai scoperto che in qualcuno dei partecipanti si è instaurato uno stato di controllo della viremia DOPO il rebound. Questo significa quello che ho cercato di spiegare nel post: che i CD4 modificati sono protetti dal virus, riescono ad arginare un po' il suo ritorno e aiutano i CD8 a contrastarlo. È troppo poco per permettere al sistema immunitario di fare da solo la sua battaglia, senza gli antiretrovirali. Ma è un bel passo nella direzione giusta.
Tutte queste cose non le scopri se sei pavido e ricominci la cART troppo in fretta.

[Dora]

SB-728-T: SECONDO AGGIORNAMENTO

Il secondo articolo sull'SB-728-T di cui desidero parlare non ha ancora passato la revisione di una rivista di prestigio. Ma il gruppo di lavoro che l'ha scritto e il fatto che i risultati delle loro ricerche siano già in buona parte stati anticipati a due congressi sulla cura di HIV presso il Fred Hutchinson Cancer Research Center negli anni scorsi mi fanno ritenere che la versione finale pubblicata non sarà troppo dissimile da quella che è stata caricata un mese fa su BiorXiv:

Infusion of CCR5 Gene-Edited T Cells Allows Immune Reconstitution, HIV Reservoir Decay, and Long-Term Virological Control.

Rafick-Pierre Sékaly ha guidato un gruppo di colleghi di diverse università fra Stati Uniti e Canada e hanno studiato i dati emersi da due vecchie sperimentazioni cliniche di fase I fatte da Sangamo sull'editing dei CD4 mediante ZFN, fra le prime fatte e completate: lo studio SB-728-0902 (su immunologic non responders) e lo studio SB-728-1101.

Analizzando i dati sulla permanenza dei CD4 modificati e le indagini sulla composizione e la misurazione dei reservoir, Sékaly e colleghi hanno individuato quella che ritengono la ragione della lunga permanenza e della prolungata espansione dei CD4 resi CCR5 negativi: la formazione, a seguito dell'editing, l'espansione e la permanenza per molti anni di una particolare popolazione di CD4 memoria con caratteristica di staminali (Tscm - T memory stem cells) - i CD45RA^intRO^int Tscm - dal fenotipo estremamente interessante, perché distinto e intermedio (int, appunto) tra i CD45RA+, che sono i linfociti T con caratteristica di staminali e i linfociti T memoria ormai completamente differenziati (Tcm - memoria centrale, Ttm - memoria transitoria e Tem - memoria effettrice, che sono tutti CD45RA-).

La caratteristica di questa popolazione intermedia di CD4 simil-staminali, che 3-4 anni dopo l'infusione costituiva fra il 3 e il 26% di tutti i CD4, è quella di essere cellule pochissimo differenziate e con la potenzialità di differenziarsi in diverse linee di linfociti T. Hanno poi una vita lunghissima, simile a quella delle cellule staminali.
Il bello di avere modificato con le ZFN dei CD4 di questo tipo è evidente: ci ritroviamo con una riserva di cellule che sono delle vere e proprie staminali memoria multipotenti, che sono protette dall'infezione da parte di HIV e hanno la capacità di andare avanti per molti anni a produrre cellule T figlie che possono differenziarsi per svolgere tutte le funzioni che svolgono i CD4 e, per di più, sono inattaccabili dal virus.
Questo, secondo Sékali e colleghi, spiega perché i CD4 CCR5 negativi continuano a persistere e a proliferare anche a distanza di molti anni dall'unica infusione e si trovano dopo anni tanti linfociti Tem, che hanno un ciclo di vita molto breve, ma che restano protetti dal virus: non ce ne sarebbero, di Tem CCR5 negativi, anni dopo l'unica infusione di SB-728-T, se non li avesse prodotti una cellula con caratteristiche di staminale CCR5 negativa.

Questo, inoltre, spiega perché una singola infusione di SB-728-T ha portato a una lenta, ma continua diminuzione del reservoir: le cellule latentemente infettate nel tempo muoiono e il reservoir non viene riempito di nuovo perché il virus trova sempre meno cellule da infettare e in cui andare in latenza.
I CD45RA^intRO^int Tscm resi CCR5 negativi sono infatti risultati correlati con il controllo della viremia nei partecipanti ai trial che hanno fatto un'interruzione terapeutica, in cui il set point virale, quando si è verificato il rebound, è stato più basso rispetto a quello raggiunto prima di iniziare la cART e alcuni dei quali si sono rivelati dei post treatment controllers.
Uno di questi, che è rimasto per 5 anni senza riprendere la cART, ha permesso ai ricercatori di studiare l'evoluzione di CD4 e CD8 nel tempo e di osservare che le risposte HIV-specifiche di entrambi questi linfociti T miglioravano anche in presenza di una replicazione virale attiva, sia pure a livelli abbastanza bassi.

La produzione di una popolazione di linfociti T simili-staminali editati dalle ZFN permetterebbe anche di evitare buona parte dei problemi legati all'editing e al trapianto autologo delle staminali, sulle quali anche Sangamo sta lavorando da tempo proprio nella speranza di avere una riserva inesauribile di cellule protette, ma che stanno incontrando tante difficoltà.

Avere una riserva di cellule memoria che vivono molto a lungo e contribuiscono alla persistenza policlonale a lungo termine di CD4 differenziati e CCR5 negativi offre poi una bella speranza agli immunologic non responders, i cui CD4 restano bassi nonostante tanti anni di soppressione virale. Vedremo se Sangamo deciderà di rivolgere la sua attenzione anche a questo vasto gruppo di persone con HIV.

[Blast]

Questo è uno studio molto bello secondo me. Pensiamo anche a tutte le persone con molteplici resistenze ai farmaci, nelle quali la ricostituzione di un sistema immunitario funzionante, data la progressiva incapacità del virus di infettare nuove cellule e replicarsi, lasciando l'arduo compito di uccidere il virus agli anticorpi, potrebbe essere la risoluzione alla loro difficile situazione clinica.

[Dora]

Lo studio TRAILBLAZER l'ho citato solo di sfuggita in un post dello scorso marzo: l'SB-728-T di Sangamo viene utilizzato per distruggere il gene ccr5 che codifica per il recettore CCR5 sui CD4 di persone con HIV sotto le 50 copie da almeno 48 settimane e più di 350 CD4.
La sperimentazione è randomizzata e in doppio cieco: significa che ad alcuni dei 30 partecipanti i CD4 vengono estratti, modificati e poi reinfusi, mentre ad altri vengono solo estratti e reinfusi, senza alcun intervento di editing genetico. La procedura di preparazione, però, la devono affrontare tutti e prevede un trattamento con ciclofosfamide prima dell'infusione dei CD4. La stessa ciclofosfamide che, stando allo studio di Tebas di cui parlammo a marzo, sembra non dare nessun beneficio.

C'è un partecipante al TRAILBLAZER, Carl Fox, che sta raccontando la sua esperienza a WCPO 9 e sembra avere una fiducia illimitata (forse anche un poco utopistica) nel trattamento cui si è sottoposto. Siamo arrivati alla terza puntata:

1. After 35 years of surviving HIV and AIDS, Carl Fox is part of a study he believes will find a cure

2. Carl Fox has lived with HIV and AIDS for decades, but now he's 'on the right path' to a cure

3. One year into TRAILBLAZER study, Carl Fox believes more than ever he'll get rid of HIV