Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più bello

Ricerca scientifica finalizzata all'eradicazione o al controllo dell'infezione.
Dora
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Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più bello

Messaggio da Dora » venerdì 2 marzo 2012, 9:21

Premessa: è capitato sovente di parlare di sogni, negli ultimi giorni. Questo thread non ha assolutamente nulla a che vedere con la “metodologia onirica” o simili idiozie.


È da qualche mese che desidero scrivere sulle endonucleasi di homing (o di inserimento) e sulla ricombinasi-Tre. Però non ho mai il tempo di raccogliere le idee ed è un argomento non proprio semplicissimo.
Ho pensato, quindi, di accennare in modo sommario qualcosa sulle endonucleasi e poi di tradurre un’intervista di Lafeuillade a Joachim Hauber, del Leibniz Insitute for Experimental Virology di Amburgo, che ha appena pubblicato un lavoro sulla ricombinasi-Tre.
Così, almeno, apro il thread e prima o poi spero di riuscire a lavorarci un po' meglio.

Molto brevemente, le endonucleasi di homing o di inserimento sono degli enzimi di restrizione, cioè delle proteine, che agiscono sul DNA delle cellule che li sintetizzano. Anche se sia la loro origine, sia la loro funzione non sono ancora del tutto chiare, la ricerca più recente tende a considerarli degli elementi genetici “egoisti”, simili ai trasposoni, perché facilitano la perpetuazione degli elementi genetici che li codificano.

Si è pensato di usare queste proteine per tagliare via il DNA dell’HIV, che si è insediato nel genoma delle cellule infette. Se questa idea dovesse funzionare, offrirebbe un APPROCCIO IN GRADO DI CURARE LE CELLULE INFETTATE DAL VIRUS: ciò che, fino ad oggi, non è stato possibile fare.

Le endonucleasi di homing fanno una sola cosa, e la fanno molto bene, con estrema precisione: vanno alla ricerca di specifiche sequenze di DNA all’interno di genomi complessi e, quando le trovano, tagliano il DNA in due.
In natura, queste endonucleasi di homing esistono entro organismi unicellulari e la loro funzione consiste nel tagliare una determinata sequenza di DNA e poi inserire una copia del loro proprio DNA entro la breccia così creata. Nelle cellule umane, il processo di riparazione del DNA funziona in modo un po’ diverso: piuttosto che inserire del materiale entro la rottura del DNA, le estremità spezzate dei filamenti del DNA vengono ricongiunte. Durante questo processo di riparazione, parte del DNA che circonda il punto di rottura va perduto e il DNAspezzato viene infine distrutto dai meccanismi di riparazione cellulare.

Immagine

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Da Keith Jerome, “Gene Therapy is the path to a Cure” – IAS 2011 – slides 5 e 4 (il sito dello IAS 2011 al momento non funziona).

Ci si è dunque chiesti che cosa accadrebbe se l’endonucleasi di homing fosse capace di trovare e spaccare, separandole, delle sequenze di DNA di un retrovirus, quale l’HIV, che si nasconde all’interno dei cromosomi delle cellule che ha infettato.

In un esperimento pubblicato l’anno scorso (Successful Targeting and Disruption of an Integrated Reporter Lentivirus Using the Engineered Homing Endonuclease Y2 I-Ani I, Keith Jerome ha indotto una endonucleasi di homing ad andare a scovare un virus, che lui stesso aveva creato perché fosse suscettibile a questo enzima.
Questo esperimento ha dimostrato che l’endonucleasi di homing è stata capace di distruggere parti del DNA virale abbastanza estese da eliminare l’espressione di proteine virali.
NON è scomparsa ogni traccia del virus; tuttavia, ciò che ne è rimasto era un guscio vuoto, inoffensivo.
Ma c’è di più: IL TRATTAMENTO NON HA DANNEGGIATO LE CELLULE.
In altre parole, LE CELLULE SONO STATE CURATE – GUARITE – DAL VIRUS.


Sfortunatamente, in natura, le endonucleasi di homing NON sono in grado di riconoscere le sequenze dell’HIV. Ma, ora che si sa che queste proteine possono eliminare un virus da una cellula umana, si può cercare di riprogettarle in modo da renderle capaci di riconoscere l’HIV.

Usando la cristallografia a raggi X, una tecnica di laboratorio che mostra la struttura delle proteine, Jerome sta cercando di visualizzare delle endonucleasi di homing legate ai loro DNA target naturali. Una volta capito che forma prendono quando si legano ai loro obiettivi naturali, dovrebbe essere possibile costruire dei modelli per predire le modificazioni strutturali che consentiranno a queste proteine di legarsi alle sequenze specifiche dell’HIV.

La fase successiva dovrebbe essere la costruzione di una endonucleasi di homing che riconosca il DNA dell’HIV e possa colpire diversi siti del genoma del virus (fra cui la Env, la Pol, la Tat e la Vif). Poiché far arrivare questi enzimi fino al genoma del virus latente nel corpo delle persone malate in modo sia specifico sia sicuro è una sfida non di poco momento, passerà ancora del tempo prima che si possa arrivare a una fase clinica.

Ricordo che degli sviluppi di questa ricerca Keith Jerome ha parlato a St Martin lo scorso dicembre (SESSION X: NEW APPROACHES & ERADICATION TRIALS - Part 2 - Direct Targeting of Integrated HIV Sequences Using Engineered Homing Endonucleases, abstract 48).



Dora
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Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Dora » venerdì 2 marzo 2012, 9:25

Quella che segue è l’intervista a Joachim Hauber su un altro tipo di nucleasi, la ricombinasi-Tre, che Lafeuillade ha appena postato nel suo sito.
Anche in questo caso, si tratta di una proteina che dovrebbe essere in grado di estrarre il DNA del virus dalle cellule infettate e su di essa Hauber, insieme a Frank Buchholz, ha appena pubblicato un articolo su PloS ONE: Excision of HIV-1 Proviral DNA by Recombinant Cell Permeable Tre-Recombinase.

Excision of HIV-1 Proviral DNA from Infected Cells

A.L.: Può spiegarci sia il principio di questa molecola capace di “escissione” del DNA provirale, sia i mezzi che ha usato per farla arrivare fin dentro il nucleo delle cellule?

J.H.: La ricombinasi-Tre è un enzima derivato dalla ricombinasi-Cre, che è stata geneticamente manipolata in vitro mediante evoluzione molecolare. La Tre riconosce e ricombina una sequenza asimmetrica (di 34 coppie di basi) nelle sequenze ripetute terminali ( Long Terminal Repeat – LTR) dell’HIV, riuscendo così a tagliar via il DNA provirale dal suo sito di integrazione nel cromosoma. Pertanto, la ricombinasi-Tre può essere un componente utile delle future terapie per eradicare.
Riguardo all’eradicazione del virus, è molto probabile che per riuscire a far arrivare la ricombinasi-Tre nelle cellule sia necessario un approccio di terapia genica in cui, sia dei CD4 adulti, sia delle staminali ematopoietiche CD34 vengano modificati geneticamente mediante dei sistemi di vettori avanzati (per esempio dei vettori lentivirali che si disattivano da soli). Tuttavia, soprattutto il trattamento ex vivo dei CD4 adulti potrebbe richiedere anche l’applicazione di una ricombinasi-Tre capace di penetrare attraverso la membrana cellulare.
Questa strategia ha il vantaggio di evitare la modificazione genetica delle cellule target dell’HIV mediante un vettore. L’enzima ricombinante Tre è caratterizzato da due aspetti: è una proteina del dominio di trasduzione (PTD) eterologa, che assicura il trasporto attraverso la membrana cellulare, o plasmatica; ed è un segnale di localizzazione nucleare (NLS), che media l’uptake nucleare.


A.L.: Quali sono le differenze rispetto all’approccio che usa le nucleasi a dita di zinco (ZFN)? C’è, come nel caso delle ZFN, il rischio di andare fuori bersaglio nell’escissione? Se sì, è quantificato? E quali ne sarebbero le conseguenze?

J.H.: Inattivando il corecettore cellulare CCR5 dell’HIV, la ZFN impedisce un’infezione de novo delle cellule target dell’HIV da parte di un virus CCR5-tropico. Invece, la ricombinasi-Tre rimuove l’HIV-1 da cellule già infettate, indipendentemente dal tropismo del virus (cioè la Tre agisce su virus CCR5-, CXCR4- e dual-tropici). Sempre a differenza della ZFN, gli enzimi derivati dalla Cre, come la ricombinasi-Tre, non producono telomeri (cioè regioni terminali dei cromosomi) liberi (che possono comportare effetti potenzialmente disastrosi, come le rotture del doppio filamento del DNA), e non richiedono fattori addizionali dell’ospite. Ne segue – e l’abbiamo confermato mediante analisi citogenetiche avanzate – che la ricombinazione mediata dalla Tre è accuratissima e non produce alcun effetto off-target nel genoma nel suo complesso.


A.L.: In quali tipi di cellule e di tessuti può far arrivare questo enzima? Se si riuscirà ad arrivare in fase clinica, questo prodotto potrà essere somministrato ai pazienti per via orale?

J.H.: Come ho detto prima, i vettori che esprimono la Tre verranno probabilmente usati in un futuro prossimo nelle terapie geniche contro l’HIV per la trasduzione di CD4 umani o, nel caso di terapie basate sulle staminali, per la modificazione genetica delle staminali ematopoietiche CD34. La ricombinasi-Tre può divenire importante nel trattamento ex vivo dei linfociti T. Tuttavia, ci sono ragioni tecniche che ne rendono non praticabile la somministrazione per via orale in un futuro prossimo, anche se certamente noi stiamo lavorando in questa prospettiva.


A.L.: Se ho capito bene, lei ritiene che questo approccio, aggiunto alla HAART, potrebbe progressivamente distruggere il reservoir dell’HIV. Quali sono le prospettive realistiche per uno sviluppo di questa tecnica in vivo?

J.H.: Noi riteniamo che la ricombinasi-Tre diverrà uno strumento importante nelle nuove strategie per eradicare l’HIV. Ci aspettiamo che l’escissione mediata dalla Tre del DNA provirale dalle cellule target dell’HIV migliori il sistema immunitario del paziente da un punto di vista funzionale; e questo sembra un aspetto critico perché si possa arrivare alla deplezione dei reservoir dell’HIV. Per quanto riguarda l’eradicazione del virus, riteniamo che la ricombinasi-Tre dovrebbe essere aggiunta alla HAART, e/o ad altri approcci di purging.
Al momento, lo sviluppo in vivo della ricombinasi-Tre si sta concentrando sull’analisi della Tre in topi umanizzati infettati da HIV, cui vengono trapiantati sia CD4 sia staminali CD34 trasdotti usando la Tre come vettore.
Quando avremo completato questi esperimenti, prevediamo di iniziare abbastanza rapidamente degli studi clinici.



NOTE
  • 1- Mariyanna L, et al. Excision of HIV-1 Proviral DNA by Recombinant Cell Permeable Tre-Recombinase. PLoS One, 2012: 7, e31576
    2- Sarkar I, et al. HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase. Science, 2007: 316, 1912-15
    3- Buchholz & Hauber. In Vitro Evolution and Analysis of HIV-1 LTR-Specific Recombinases. Methods 2011: 53,102-9




Ricordo che, la settimana prossima, al CROI Hauber non ci sarà, ma Bucholtz porterà un lavoro sempre di terapia genica su topi umanizzati:
432 - Modified Trimera Mice as Novel Humanized Mouse Model for HIV Gene Therapy in Acute Infection



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Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da uffa2 » venerdì 2 marzo 2012, 9:32

Neppure il più scatenato autore di fantascienza avrebbe osato, trent’anni fa, ipotizzare roba del genere e, per quanto avrei preferito poter coltivare una sana ignoranza su simili vette della ricerca scientifica, non posso che restare ammirato…


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Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Dora » venerdì 2 marzo 2012, 9:36

uffa2 ha scritto:Neppure il più scatenato autore di fantascienza avrebbe osato, trent’anni fa, ipotizzare roba del genere e, per quanto avrei preferito poter coltivare una sana ignoranza su simili vette della ricerca scientifica, non posso che restare ammirato…
Affascinante, vero? Quando ho iniziato a leggere qualcosa, dietro suggerimento di Leon, sono rimasta ammaliata. Però sono un argomento così difficile, che non avevo il coraggio di affrontarlo.



nordsud
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Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da nordsud » venerdì 2 marzo 2012, 13:52

Quando avremo completato questi esperimenti, prevediamo di iniziare abbastanza rapidamente degli studi clinici.
Poiché far arrivare questi enzimi fino al genoma del virus latente nel corpo delle persone malate in modo sia specifico sia sicuro è una sfida non di poco momento, passerà ancora del tempo prima che si possa arrivare a una fase clinica.

Passerà molto tempo o inizieranno abbastanza in fretta gli studi clinici ?
Sia chiaro che non si potrebbe sperare di meglio per eradicare completamente un virus.



Dora
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Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Dora » venerdì 2 marzo 2012, 15:03

nordsud ha scritto:
Quando avremo completato questi esperimenti, prevediamo di iniziare abbastanza rapidamente degli studi clinici.
Poiché far arrivare questi enzimi fino al genoma del virus latente nel corpo delle persone malate in modo sia specifico sia sicuro è una sfida non di poco momento, passerà ancora del tempo prima che si possa arrivare a una fase clinica.
Passerà molto tempo o inizieranno abbastanza in fretta gli studi clinici ?
Sia chiaro che non si potrebbe sperare di meglio per eradicare completamente un virus.
Non sono sicura che ci sia una contraddizione, a parte il fatto che la prima citazione riguarda un enzima e la seconda un altro.
La questione è se questi enzimi possono essere testati su CD4 o CD34 (infetti, magari anche latentemente infetti) prelevati dai pazienti e poi reinfusi (sul genere di quanto sta facendo Sangamo con le ZFN che tagliano via il CCR5), e questo traguardo potrebbe essere anche abbastanza vicino; oppure se si possano iniettare direttamente nel paziente le endonucleasi o le ricombinasi-Tre e aspettarsi che vadano dritte al bersaglio da sole, traguardo che, invece, pare ancora abbastanza lontano.
Almeno, io l'ho capita così.



Tarek
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Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Tarek » sabato 3 marzo 2012, 3:39

Interessante, ma dove le prendete tutte queste informazioni?
(è proprio un bel sogno :D )



skydrake
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Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da skydrake » sabato 3 marzo 2012, 7:41

Rimane però da risolvere il problema principale: individuare le cellule infette.
Tuttavia, soprattutto il trattamento ex vivo dei CD4 adulti potrebbe richiedere anche l’applicazione di una ricombinasi-Tre capace di penetrare attraverso la membrana cellulare.
Sono trent'anni che stanno cercando una proteina superficiale da agganciare o comunque un marcatore che permetta di distinguerle da quelle sane.

Che facciano entrare un enzima ricombinante che sani la cellula o una tossina che la distrugga, poco conta (tranne nel cervello). L'importante è far fuori i reservoirs.



Dora
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Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Dora » sabato 3 marzo 2012, 8:34

skydrake ha scritto:Rimane però da risolvere il problema principale: individuare le cellule infette.
Tuttavia, soprattutto il trattamento ex vivo dei CD4 adulti potrebbe richiedere anche l’applicazione di una ricombinasi-Tre capace di penetrare attraverso la membrana cellulare.
Sono trent'anni che stanno cercando una proteina superficiale da agganciare o comunque un marcatore che permetta di distinguerle da quelle sane.
Che facciano entrare un enzima ricombinante che sani la cellula o una tossina che la distrugga, poco conta (tranne nel cervello). L'importante è far fuori i reservoirs.
È possibilissimo che io non abbia capito granché di quel che sto studiando, ma ho l'impressione che questa obiezione non sia molto centrata, in quanto l'idea (l'obiettivo) mi pare che sia che l'endonucleasi, opportunamente costruita, entri in qualsiasi cellula e vada a cercarsi il suo specifico bersaglio: qualche pezzettino del DNA dell'HIV, che questo enzima distrugge, rendendo inoffensivo il virus. E soltanto quello, riuscendo a non danneggiare il resto della cellula nel cui genoma il virus si è integrato. Se di virus non ne trova, tanto meglio. E la cosa si risolve così.

Per questo ho parlato di un sogno. Mi rendo conto che siamo ai balbettii iniziali e che di lavoro da fare ce n'è ancora moltissimo; ma ritengo che sia un approccio all'eradicazione davvero meraviglioso.



Dora
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Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Dora » sabato 3 marzo 2012, 8:43

flavio ha scritto:Interessante, ma dove le prendete tutte queste informazioni?
(è proprio un bel sogno :D )
Carino, vero? Dopo tanti giorni passati ad avvelenarmi con la Yoghurt Connection avevo proprio bisogno di disintossicarmi un po’. Non potendo fare camminate di ore, ho ripreso in mano le endonucleasi.
Ne avevo letto qualcosa quando Keith Jerome ne aveva parlato al seminario all’isola dei pirati tre mesi fa. Parallelamente, Leon mi aveva ricordato certe cose che aveva scritto lui sulla ricombinasi-Tre. Poi ho lasciato sedimentare il discorso, perché è difficile e richiede – almeno a me – ancora tanto studio. Diciamo che l’intervista di Lafeuillade a Hauber mi ha fornito una specie di “sostituto funzionale” di una camminata disintossicante …

Nella fretta di ieri non ho lasciato un po’ di riferimenti, per chi avesse desiderio di approfondire la questione.

Partiamo dalla ricombinasi-Tre, tenendo conto che le persone che se ne occupano di più sono Joachim Hauber, appunto, e Franz Bucholtz, che lavora al Max Plank Institute di Dresda, e ricostruiamone la storia, almeno dal punto di vista di quel che si trova in letteratura:

Passiamo ora alle endonucleasi di homing: se guardi su PubMed, trovi una letteratura sterminata; attualmente, infatti, sono indicizzati ben 403 lavori su questi enzimi, che vengono studiati ormai da almeno una ventina d’anni. Lascio quindi perdere tutto e segnalo solo un paio di cose di Keith Jerome, della University of Washington:



P.S. Non so quando (e in realtà neppure "se"), perché ora inizia il CROI e vorrei occuparmi di quello, ma spero di riuscire a raccontare qualcosa, mettendo insieme una review non proprio recentissima perché del 2009, ma utile e completa, sulle meganucleasi e una più recente sugli approcci di terapia genica, che tratta anch'essa delle endonucleasi. Questo potrebbe servire a inquadrare meglio questi straordinari enzimi.



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