Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più bello

Ricerca scientifica finalizzata all'eradicazione o al controllo dell'infezione.
skydrake
Messaggi: 9918
Iscritto il: sabato 19 marzo 2011, 1:18

Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da skydrake » sabato 3 marzo 2012, 10:14

Dora ha scritto:
skydrake ha scritto:Rimane però da risolvere il problema principale: individuare le cellule infette.
Tuttavia, soprattutto il trattamento ex vivo dei CD4 adulti potrebbe richiedere anche l’applicazione di una ricombinasi-Tre capace di penetrare attraverso la membrana cellulare.
Sono trent'anni che stanno cercando una proteina superficiale da agganciare o comunque un marcatore che permetta di distinguerle da quelle sane.
Che facciano entrare un enzima ricombinante che sani la cellula o una tossina che la distrugga, poco conta (tranne nel cervello). L'importante è far fuori i reservoirs.
È possibilissimo che io non abbia capito granché di quel che sto studiando, ma ho l'impressione che questa obiezione non sia molto centrata, in quanto l'idea (l'obiettivo) mi pare che sia che l'endonucleasi, opportunamente costruita, entri in qualsiasi cellula e vada a cercarsi il suo specifico bersaglio: qualche pezzettino del DNA dell'HIV, che questo enzima distrugge, rendendo inoffensivo il virus. E soltanto quello, riuscendo a non danneggiare il resto della cellula nel cui genoma il virus si è integrato. Se di virus non ne trova, tanto meglio. E la cosa si risolve così.

Per questo ho parlato di un sogno. Mi rendo conto che siamo ai balbettii iniziali e che di lavoro da fare ce n'è ancora moltissimo; ma ritengo che sia un approccio all'eradicazione davvero meraviglioso.
L'ipotesi di entrare in TUTTE le cellule mi pareva pericolosa. Qui stiamo a giocare con il DNA. Se si trattava di entrare solo nei reservoirs questi enzimi potevano permettersi anche di fare danni. Ma entrare in TUTTE le cellule o, perlomeno tutti i CD4 e macrofagi, significa entrare in un numero di cellule milioni di volte superiore a quello dei reservoirs, quindi si moltiplica di milioni di volte la seppur minima probabilità di mutazioni.



Dora
Messaggi: 7491
Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48

Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Dora » sabato 3 marzo 2012, 11:43

skydrake ha scritto:L'ipotesi di entrare in TUTTE le cellule mi pareva pericolosa. Qui stiamo a giocare con il DNA. Se si trattava di entrare solo nei reservoirs questi enzimi potevano permettersi anche di fare danni. Ma entrare in TUTTE le cellule o, perlomeno tutti i CD4 e macrofagi, significa entrare in un numero di cellule milioni di volte superiore a quello dei reservoirs, quindi si moltiplica di milioni di volte la seppur minima probabilità di mutazioni.
Beh, è ben per questo che con TUTTE le terapie geniche si deve andare coi piedi di piombo. Non stiamo parlando di aspirine. Ti bastano i dieci anni di follow-up pretesi dall'FDA per qualsiasi trial clinico che involva modificazioni genetiche?
D'altra parte, stando a quel che dicono i cultori delle mega-endonucleasi, pare che queste diano molti meno problemi di effetti off-target rispetto alle ZFN, con i rischi di mutagenesi e carcinogenesi connessi. Insomma, sembra che la precisione di questi enzimi sia davvero fantastica.
Watching ...



Dora
Messaggi: 7491
Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48

Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Dora » domenica 24 giugno 2012, 10:01

Con il CROI e tutto quel che ne è seguito, ho finito con il trascurare la questione della ricombinasi-Tre.
La riaffronteremo fra un mese, perché Buchholtz e Hauber presenteranno ad AIDS 2012 un aggiornamento del loro lavoro (Towards HIV eradication: excision of HIV-1 proviral DNA by Tre-recombinase in HIV-positive humanized mice). Tuttavia, mi sono appena imbattuta nell’ultimo numero degli IAVI Reports (Vol. 16 (2), Mar.-Apr. 2012), in cui Andreas von Bubnoff racconta brevemente dei risultati usciti dal Keystone Symposium dedicato a Virus Entry, Replication and Pathogenesis: Stalking HIV's Sleeper Cells.
Poiché fra poche settimane di ricombinasi-Tre sentiremo di nuovo parlare, e poiché l’argomento mi affascina molto, riporto qui la parte in cui si descrive una ricerca di Jan Chemnitz dell’Heinrich Pette Institute di Amburgo dedicata al tentativo di escissione del DNA dell’HIV integrato nel genoma delle cellule.


Chemnitz e colleghi hanno dato vita in laboratorio a dei topi umanizzati che esprimono la ricombinasi-Tre, che – come abbiamo visto – è un enzima capace di estrarre il DNA virale dal genoma delle cellule infette. Per riuscirci, hanno modificato sia dei CD4, sia delle staminali ematopoietiche CD34 mediante un vettore lentivirale, che esprimeva la ricombinasi-Tre e poi hanno iniettato le cellule modificate geneticamente in alcuni topi umanizzati, in modo che le cellule potessero ripopolare il loro sistema immunitario.

Quando hanno infettato i topi con l’HIV-1, hanno scoperto che i topi che esprimevano l’enzima avevano viremie notevolmente più basse e CD4 più alti rispetto ai topi che non lo esprimevano.
Questo – ha dichiarato Chemnitz – è il primo approccio capace di rimuovere il DNA provirale di varianti wild type di HIV circolante dal genoma di una cellula infetta; ed è la prima proof of concept in un modello in vivo che questo approccio può indebolire l’infezione. Ad alcuni animali è andata meglio che ad altri.

Nella sua versione corrente, questa strategia NON È CAPACE DI ESTRARRE HIV DNA DA CELLULE LATENTEMENTE INFETTE, PERCHÉ LA PROTEINA TAT DELL’HIV (CHE È PRESENTE SOLO NELLE CELLULE PRODUTTIVAMENTE INFETTE) DEVE ESSERE PRESENTE PER INDURRE L’ESPRESSIONE DELLA RICOMBINASI.

Tuttavia, trasfondere ai pazienti dei CD4 o delle CD34 che esprimono la ricombinasi dovrebbe aiutare ad aumentare la proporzione di cellule immunitarie sane, in grado di sbarazzarsi dell’HIV quando vengono infettate.

SE A CIÒ SI AGGIUNGE UN TRATTAMENTO CHE RIATTIVA IL RESERVOIR LATENTE, QUESTO SISTEMA IMMUNITARIO PIÙ SANO POTREBBE ESSERE PIÙ ABILE AD UCCIDERE SIA LE CELLULE INFETTE, SIA QUELLE RIATTIVATE.

Un limite di questo approccio consiste nel fatto che la ricombinasi-Tre usata negli esperimenti può estrarre solo il DNA integrato di un HIV di tipo A presente in Tanzania.

La continuazione della ricerca di Chemnitz consiste pertanto nella progettazione di una ricombinasi in grado di estrarre molte altre varianti di HIV. Inoltre, l’obiettivo è anche quello di modificare questa strategia in modo da arrivare a colpire anche il reservoir latente, sviluppando dei vettori lentivirali che possano essere usati per estrarre l’HIV DNA dalle cellule latentemente infette, anche in assenza della Tat.

Il progetto è di arrivare in fase clinica entro un paio di anni.



Dora
Messaggi: 7491
Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48

Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Dora » mercoledì 25 luglio 2012, 7:16

Dora ha scritto:Con il CROI e tutto quel che ne è seguito, ho finito con il trascurare la questione della ricombinasi-Tre.
La riaffronteremo fra un mese, perché Buchholtz e Hauber presenteranno ad AIDS 2012 un aggiornamento del loro lavoro
Ed ecco qui l'abstract di Hauber, Buchholtz e colleghi, ad approfondimento del lavoro sulla capacità della ricombinasi-Tre di agire sull'HIV in vivo (effetti citopatici su colture cellulari e su topi umanizzati): la ricombinasi-Tre, stando a quanto dice Hauber, trasportata da un vettore lentivirale che si auto-disattiva una volta espletato il suo compito, riesce ad estrarre il DNA provirale dal suo sito di integrazione nei cromosomi sia dei CD4, sia delle staminali; sembra che non produca effetti citopatici indesiderati; ha attività antivirale nei topi.

Towards HIV eradication: excision of HIV-1 proviral DNA by Tre-recombinase in HIV-positive humanized mice

Presented by Helga Hofmann-Sieber (Germany).

H. Hofmann-Sieber1, I. Hauber1, J. Chemnitz1, A. Grundhoff1, J. Chusainow2, A. Schambach3, C. Baum3, P. Ziegler4, M. Manz5, F. Buchholz2, J. Hauber1

1Heinrich Pette Institute - Leibniz Institute for Experimental Virology, Hamburg, Germany, 2University of Technology Dresden, University Hospital and Medical Faculty Carl Gustav Carus, Department of Medical Systems Biology, Dresden, Germany, 3Hannover Medical School, Institute of Experimental Hematology, Hannover, Germany, 4Institute for Research in Biomedicine, Bellinzona, Switzerland, 5University Hospital Zurich, Zurich, Switzerland


Background: HIV-1 integrates into the host chromosome and persists as a provirus flanked by long terminal repeats (LTR). To date, treatment regimens primarily target the virus enzymes or virus entry, but not the integrated provirus. Therefore, HAART requires lifelong treatment which is frequently accompanied by the occurrence of substantial side effects and/or the development of drug-resistant viruses.
Previously, we engineered a LTR-specific recombinase (Tre-recombinase) that effectively excises integrated HIV-1 proviral DNA from infected human cell cultures, suggesting that customized enzymes might someday help to eradicate HIV-1 from the body. Therefore, we here analyzed the potential of Tre-recombinase to reverse HIV-1 infection in vivo.

Methods: We constructed an advanced lentiviral self-inactivating (SIN) vector that expresses Tre-recombinase conditionally in HIV-infected cells. We monitored Tre functionality and potential Tre-related cytopathic effects over time in tissue cultures. Moreover, the effect of Tre activity on HIV-1 infection was investigated in humanized mice.

Results: It is shown that Tre-recombinase is efficiently delivered into cells and accurately excises HIV-1 proviral DNA from chromosomal integration sites. Apparently, prolonged overexpression of Tre-recombinase does not induce undesired cytopathic effects in the transduced cells. Finally, we demonstrate pronounced antiviral activity of Tre-recombinase in HIV-1 infected Rag2-/-γc-/- mice, which were either engrafted with Tre-transduced human CD4+ T cells or with Tre-transduced human CD34+ hematopoietic stem cells (HSC).

Conclusions: The presented data suggest that Tre-recombinase may be a valuable component of future antiretroviral therapies of the post HAART era that aim at virus eradication, thereby providing a cure for AIDS.



Leon
Messaggi: 1462
Iscritto il: mercoledì 21 febbraio 2007, 7:33

Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Leon » mercoledì 25 luglio 2012, 18:39

Eh sì, proprio "di tutti i sogni, il più bello", ma un sogno ("might someday help to eradicate").



Dora
Messaggi: 7491
Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48

Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Dora » domenica 8 settembre 2013, 8:09

Mi sono imbattuta l'altro giorno in un lavoro pubblicato a giugno online ed ora nel numero di settembre di Nucleic Acid Research, in cui si racconta di un uso delle nucleasi a dita di zinco molto diverso da quello di cui siamo abituati a leggere, e invece affine ai lavori sulle endonucleasi di cui parliamo in questo thread: Xiyingn Qu, Huanzhang Zhu e tanti collaboratori della Fudan University, dell'Institut Pasteur e dell'Accademia Cinese delle Scienze - tutti di Shanghai - hanno costruito appositamente e poi utilizzato delle ZFN per estirpare il DNA provirale dell'HIV-1 da CD4 umani sia attivamente, sia latentemente infetti.

È la prima volta che mi capita di scrivere di una ricerca fatta in Cina e mi mancano termini di paragone locali, ma i due autori principali dello studio - il professor Qu e il professor Zhu - hanno all’attivo molte ottime pubblicazioni e la rivista ha un IF quasi stratosferico (per intenderci, nulla di neppure lontanamente paragonabile né al Journal of Medical Virology di Yamamoto, che ha impact factor 2.373 né, tanto meno, all’IJAE - a detta di Brian Owens, il direttore di Nature News, "a journal you've never heard of" - il cui IF quest’anno è ancora indeterminato, ma l’anno scorso si aggirava intorno allo 0,qualcosa).

Inoltre, una ricerca analoga viene svolta anche alla UC Davis da David Segal, Direttore del Dipartimento di Genomica che, basandosi sull’ipotesi che l’abolizione o la distruzione ex vivo o addirittura in vivo di geni dell’HIV mediante mutagenesi o mediante estirpazione possa annullare in modo irreversibile la capacità del virus di replicarsi e sopravvivere, sta progettando delle nucleasi a dita di zinco per tagliare a pezzettini il DNA provirale integrato nelle cellule senza coinvolgere alcuna sequenza umana. Questo potrebbe inattivare definitivamente il virus e potrebbe funzionare anche in persone che ospitano un virus R4-tropico, alle quali bloccare il CCR5 come sta cercando di fare Sangamo servirebbe a poco.
Al lavoro di Segal mi è capitato di accennare poco più di un anno fa, quando ha presentato questa sua ricerca ad AIDS 2012.

Quello che mi spinge a parlare qui della ricerca cinese è il fatto che questa tecnologia, a differenza di quella di Segal, è stata in grado di raggiungere anche cellule latentemente infette, mentre la ricombinasi Tre di cui parliamo in questo thread fino ad ora è stata diretta solo contro cellule attivate.
È vero però che chi studia le endonucleasi di homing sostiene che sono molto più precise delle ZFN, che sono invece responsabili di un ancora troppo alto numero di off-target.

E proprio con una critica alla ricombinasi Tre esordisce l’articolo di Qu, Zhu e colleghi.
Il provirus integrato, che si localizza fra le sequenze ripetute terminali (Long Terminal Repeat – LTR), da un lato costituisce la base per la trascrizione genetica dell’HIV nelle cellule infette, dall’altro è ciò che consente che il tempo di latenza dell’HIV nelle cellule quiescenti possa essere molto lungo. Una strategia di eradicazione potrebbe dunque indirizzarsi proprio alla distruzione del provirus integrato nelle cellule. E questo è infatti l’obiettivo della ricombinasi Tre sviluppata da Buchholtz come mutante della ricombinasi Cre, che riconosce una sequenza localizzata sull’LTR dell’HIV di ceppo TZB003 e riesce effettivamente a distruggere il provirus da dentro la cellula infetta.

Il problema, a detta di Qu e Zhu, è che questo ceppo particolare dell’HIV è atipico ed è stato scelto per la sua somiglianza alla sequenza di DNA che viene riconosciuta dalla ricombinasi Cre, la nucleasi “wild type” da cui tutto il lavoro di Buchholtz è partito. Le sequenze LTR di tutti gli altri ceppi del virus sono molto diverse e quindi è improbabile che questo approccio possa essere generalizzato ai vari HIV che sono rilevanti da un punto di vista clinico, soprattutto tenendo conto che le quasispecie presenti nei pazienti in fasi avanzate dell’infezione sono molte.

La caratteristica utile delle nucleasi a dita di zinco, invece, è che possono essere progettate in modo da far loro distruggere non – come fa per esempio Sangamo - qualche gene umano, ma piuttosto l’intero provirus integrato dell’HIV. E questo è quello che Qu e Zhu hanno fatto, chiedendo a Sigma-Aldrich di produrre delle ZFN che colpiscono una sequenza all’interno dell’LTR, che è una regione del genoma dell’HIV molto stabile ed è conservata in tutte le ramificazioni di tutti i ceppi del virus.

Sono state così create le ZFN LTR e – in una serie di esperimenti che, da quanto riesco a capire, sono stati molto precisi e accurati e possono essere letti direttamente nell’articolo – si è dimostrato che

  • • sono state capaci di distruggere il DNA provirale in linee cellulari infette;
    • sono state capaci di fare la stessa cosa in linfociti T primari;
    • e – questa, per quanto ne so, la vera novità – sono state capaci di fare tutto questo anche in linee di cellule Jurkat latentemente infette.


L’efficienza con cui il DNA provirale è stato distrutto è relativamente alta, con una frequenza di estirpazione di quasi il 46%, che è in linea con il circa 50% di distruzione del CCR5 di ricerche come quella di Sangamo.
Dopo di ché sono state indagate la sicurezza delle ZFN LTR e la quantità di effetti off-target e la conclusione di Qu e Zhu è che i dati raccolti dimostrano una genotossicità minima delle ZFN LTR e suggeriscono che siano altamente specifiche contro il provirus dell’HIV-1. Di off-target, infatti, non ne sono stati trovati.
La pur minima tossicità potrebbe essere ulteriormente ridotta, prima che si passi a sperimentare sui topi, sia diminuendo la concentrazione di ZFN LTR necessarie a tagliare la sequenza-target, sia migliorandone ancor di più la specificità.





Fonte: Zinc-finger-nucleases mediate specific and efficient excision of HIV-1 proviral DNA from infected and latently infected human T cells.



uffa2
Amministratore
Messaggi: 6752
Iscritto il: lunedì 26 novembre 2007, 0:07

Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da uffa2 » lunedì 9 settembre 2013, 11:06

Questo ultimo post di Dora è galattico.
Con tutti i caveat, pur sapendo che dai vetrini alla pratica clinica passano almeno i lustri, non si può non restare estasiati...


HIVforum ha bisogno anche di te!
se vuoi offrire le tue conoscenze tecniche o linguistiche (c'è tanto da tradurre) o sostenere i costi per mantenere e sviluppare HIVforum, contatta con un PM stealthy e uffa2, oppure scrivi a staff@hivforum.info

Dora
Messaggi: 7491
Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48

Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Dora » martedì 1 ottobre 2013, 9:35

Leon ha scritto:
Eh sì, proprio "di tutti i sogni, il più bello", ma un sogno ("might someday help to eradicate").
Ci hanno messo un anno, ma la ricerca portata ad AIDS 2012 da Hauber e Buchholtz è ora un articolo su PLoS PATHOGENS: Highly Significant Antiviral Activity of HIV-1 LTR-Specific Tre-Recombinase in Humanized Mice.
L’estate dell’anno scorso, le questioni principali rimaste aperte sulla ricombinasi-Tre erano due, ed entrambe di dirimente importanza:

  • 1) la necessità di progettare una ricombinasi in grado di estrarre molte e diverse varianti di HIV-1 e non soltanto il ceppo A prevalentemente diffuso in Tanzania e

    2) la necessità di arrivare a colpire anche il reservoir latente, sviluppando dei vettori lentivirali che possano essere usati per estrarre l’HIV DNA dalle cellule latentemente infette, dove non si trova espressione della proteina virale Tat, dalla quale dipende l’espressione di questa ricombinasi-Tre.


Leggendo l’articolo, si vede che alla prima questione si è più vicini a dare una risposta che alla seconda.
D’altra parte, mentre l’affascinante lavoro cinese sulle ZFN LTR di cui abbiamo parlato qualche settimana fa è ancora alla fase dei test sulle linee cellulari, la ricerca di Hauber e Buchholtz è già passata alla fase in vivo sui topi, quindi procede abbastanza speditamente verso la fase clinica (un anno fa speravano di arrivarci in un paio d’anni – ora non so se abbiano allontanato ulteriormente l’inizio della sperimentazione sugli uomini, perché né l’articolo, né un breve comunicato stampa dell’Università di Dresda si sbilanciano in previsioni sui tempi).

In questo post vorrei molto brevemente raccontare i risultati presentati da Buchholtz e Hauber su PLoS e poi riprendere un confronto fra nucleasi a dita di zinco e ricombinasi-Tre spiegato in modo abbastanza semplice in un articolo teorico che hanno pubblicato all’inizio di quest’anno su Antiviral Research (Engineered DNA modifying enzymes: Components of a future strategy to cure HIV/AIDS), per infine concludere con la loro idea di quale possa essere una efficace strategia di cura.

I RISULTATI AD OGGI

In questo lavoro, Buchholtz, Hauber e colleghi hanno analizzato l’espressione della ricombinasi-Tre in cellule umane della linea linfoide e ne hanno dimostrato l’attività in assenza di effetti dannosi sulle cellule. La Tre colpisce una specifica sequenza della regione LTR dell’HIV-1 e in questo modo riesce a estirpare il DNA provirale integrato dal genoma delle cellule infette. Ora si è dimostrato che – in vitro – tutto questo è riuscita a farlo senza generare tossicità che compromettano la funzionalità della cellula (citotossicità) e senza ricombinare, né in alcun modo alterare, sequenze di cromosomi umani (genotossicità).

La seconda parte di questa ricerca è consistita in una analisi in vivo, che ha dimostrato molto consistenti effetti antivirali della ricombinasi-Tre in topi umanizzati infettati con l’HIV-1. L’analisi è stata duplice, perché ai topi sono stati trasfusi o linfociti T CD4+ (con circa il 60% di cellule modificate) o cellule staminali/progenitrici CD34+ (quelle modificate sono state circa il 30%). Poi i topi sono stati infettati e si è visto che anche una protezione parziale delle cellule target dell’HIV ha consentito di raggiungere effetti antivirali molto significativi (p<0,0001 sia nel caso dei CD4, sia in quello delle CD34).

La procedura per il trattamento ex vivo dei CD4 è meno complicata rispetto a quella delle staminali, ma l’obiettivo della prima può essere “solo” una cura funzionale, perché assicura degli effetti soltanto transitori, mentre la seconda può mirare all’eradicazione, perché consente un ripopolamento continuo di cellule che esprimono la Tre e, se vengono infettate, sono capaci di rimuovere il DNA provirale che si integra nel loro genoma, rimanendo funzionalmente immunocompetenti. L’idea di qualsiasi terapia genica (ancora da dimostrare nella clinica) è che le cellule resistenti all’HIV verranno selezionate in vivo, così che il sistema immunitario del paziente verrà ricostituito nella sua piena funzionalità e sarà capace di contribuire all’eliminazione dei reservoir.


NUCLEASI A DITA DI ZINCO E RICOMBINASI-TRE

Le ZFN sono degli enzimi capaci di modificare il DNA. Il taglio che causano alla stringa di DNA quando distruggono o inseriscono un gene viene riparato dai meccanismi autoriparatori del DNA stesso e qui possono intervenire degli errori, che possono comportare sia la delezione, sia l’aggiunta di basi che non c’entrano nulla. Questa tecnologia può dunque comportare degli effetti indesiderati, che vanno da un certo grado di tossicità che può danneggiare la cellula alla distruzione di sequenze di genoma che in qualche modo assomigliano a quella che deve essere modificata. Questi ultimi sono i cosiddetti “effetti off target” di cui abbiamo parlato tante volte discutendo della ricerca di Sangamo e sono particolarmente preoccupanti quando a venir modificate sono le cellule staminali.

Il problema della genotossicità causata da una distruzione di geni non ben mirata può essere evitato se invece di usare le ZFN si usano le TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases), che sono molto più specifiche, ma per ora ancora scarsamente utilizzate (è da moltissimo tempo che mi ripropongo di aprire un thread sulle TALEN e spero prima o poi di riuscire a farlo. Per il momento: http://www.hivforum.info/forum/viewtopi ... 403#p27403).

La strategia di distruggere con le ZFN il gene che codifica per il recettore CCR5, inoltre, non consente di bloccare l’infezione se è presente un virus che sa usare un altro co-recettore, cioè un virus X4- o dual-tropico (e questo l’abbiamo purtroppo visto quando ad alcuni pazienti nel trial di Sangamo sui CD4 modificati è stata sospesa la terapia e quasi subito è emerso un virus X4, che ha imposto un’immediata ripresa della ART).

Queste endonucleasi, come le ZFN, le TALEN e anche le endonucleasi di homing (HE), possono essere usate anche per colpire direttamente il DNA provirale integrato dell’HIV (un caso di distruzione dell’LTR dell’HIV-1 con le ZFN l’abbiamo visto raccontando la ricerca di Qu, Zhu e colleghi di Shanghai).
In questo caso, viene indotta una rottura del doppio filamento (DBS – double strand break) in una regione essenziale all’interno del provirus, che viene seguita da riparazione da parte della cellula, con le possibilità di errore già segnalate (NHEJ – non homologous end joining).

Ad oggi, però, nessuna endonucleasi di homing si è dimostrata capace di riconoscere una sequenza dell’HIV. Invece, la ricombinasi-Tre sì, poiché è costruita per riconoscere proprio una sequenza che si trova negli LTR provirali e può dunque far regredire un’infezione che si è già stabilita all’interno di una cellula, perché asporta dal genoma della cellula ospite tutti (e soli) i geni del virus che riesce a riconoscere, rendendo il virus incapace di agire.

Questo processo, inoltre, rimuove sia i virus che usano il CCR5, sia quelli che usano il CXCR4, perché è indipendente dal tropismo virale.


Immagine

Adattamento mio dalle fig. 2 e 3 di Engineered DNA modifying enzymes: Components of a future strategy to cure HIV/AIDS.

Prima che la Tre possa essere usata in sperimentazioni sugli uomini, devono essere risolti alcuni problemi. In particolare:
  • 1. Inizialmente, la ricombinasi-Tre è stata progettata contro un ceppo specifico di HIV-1: il sottotipo A. Perché serva davvero, bisogna riuscire a farle riconoscere la maggioranza di ceppi e varianti di HIV-1 e il fatto che molto di recente siano state identificate delle sequenze altamente conservate dell’LTR dell’HIV-1 permetterà di costruire delle ricombinasi-Tre avanzate, che colpiranno uno spettro molto vasto di sottotipi virali.

    2. Il trattamento con la Tre potrebbe selezionare dei virus resistenti, con una mutazione nell’LTR che li renda immuni all’azione della Tre. Anche in questo caso, l’avere identificato sequenze degli LTR che si ritrovano identiche in tante sottospecie di virus dovrebbe permettere di evitare il problema delle resistenze.

    3. Poiché tutte le terapie geniche si portano appresso il rischio di effetti citopatici causati dai vettori lentivirali che si devono usare per portare gli enzimi fino al luogo in cui possono agire e che continuano ad esprimere dei transgeni estranei all’organismo ospite (con possibili effetti immunogeni associati agli antigeni virali), la Tre è stata costruita in modo che il vettore che la trasporta si disattivi da solo nel momento in cui ha completato la propria funzione. Il problema è che questo vettore utilizza la Tat, che viene espressa soltanto in cellule produttivamente infette. Questo impedisce l’asportazione del provirus nelle cellule latentemente infette.


Per usare la ricombinasi-Tre in una strategia di cura eradicante ci sono dunque due strade (e mezzo): o si riesce a costruirne una che non si serva della Tat; o si scopre qualche livello residuo di Tat nelle cellule quiescenti latentemente infette cui “agganciarsi” per permettere l’espressione della Tre anche all’interno dei reservoir; oppure si inserisce la Tre in una strategia più complessa, che preveda anche l’uso di sostanze antilatenza per ripulire i reservoir.


L’ERADICAZIONE – COME LA VEDONO BUCHHOLTZ E HAUBER

Da quanto detto finora, si può immaginare che finché la ricombinasi-Tre non sarà libera dal vincolo della Tat da sola riuscirà a fare poco. L’idea è dunque di combinare insieme trattamenti farmacologici, vaccinazioni terapeutiche e terapia genica: le terapie geniche modificano le cellule del sistema immunitario in modo da renderle resistenti all’HIV. A sua volta, questo contribuisce a migliorare le risposte immuni del paziente che, in sinergia con farmaci anti-latenza che hanno il compito di diminuire le dimensioni dei reservoir, distruggono le cellule latentemente infette rimaste.
In sostanza, un approccio che vede la combinazione della ricombinasi-Tre con HDACi come il SAHA, che rimodellano la cromatina attivando il provirus latente, e naturalmente la ART, che impedisce infezioni de novo durante la riattivazione del reservoir di virus latente.
Dal momento però che si è visto che riattivare il virus latente non basta per distruggere le cellule infette, anche l’intervento di un vaccino terapeutico che rinforzi le reazioni citolitiche dei CD8 sarebbe il benvenuto.



Dora
Messaggi: 7491
Iscritto il: martedì 7 luglio 2009, 10:48

Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da Dora » giovedì 19 dicembre 2013, 9:12

Dora ha scritto:Prima che la Tre possa essere usata in sperimentazioni sugli uomini, devono essere risolti alcuni problemi. In particolare:
  • 1. Inizialmente, la ricombinasi-Tre è stata progettata contro un ceppo specifico di HIV-1: il sottotipo A. Perché serva davvero, bisogna riuscire a farle riconoscere la maggioranza di ceppi e varianti di HIV-1 e il fatto che molto di recente siano state identificate delle sequenze altamente conservate dell’LTR dell’HIV-1 permetterà di costruire delle ricombinasi-Tre avanzate, che colpiranno uno spettro molto vasto di sottotipi virali.

    2. Il trattamento con la Tre potrebbe selezionare dei virus resistenti, con una mutazione nell’LTR che li renda immuni all’azione della Tre. Anche in questo caso, l’avere identificato sequenze degli LTR che si ritrovano identiche in tante sottospecie di virus dovrebbe permettere di evitare il problema delle resistenze.

    3. Poiché tutte le terapie geniche si portano appresso il rischio di effetti citopatici causati dai vettori lentivirali che si devono usare per portare gli enzimi fino al luogo in cui possono agire e che continuano ad esprimere dei transgeni estranei all’organismo ospite (con possibili effetti immunogeni associati agli antigeni virali), la Tre è stata costruita in modo che il vettore che la trasporta si disattivi da solo nel momento in cui ha completato la propria funzione. Il problema è che questo vettore utilizza la Tat, che viene espressa soltanto in cellule produttivamente infette. Questo impedisce l’asportazione del provirus nelle cellule latentemente infette.


Per usare la ricombinasi-Tre in una strategia di cura eradicante ci sono dunque due strade (e mezzo): o si riesce a costruirne una che non si serva della Tat; o si scopre qualche livello residuo di Tat nelle cellule quiescenti latentemente infette cui “agganciarsi” per permettere l’espressione della Tre anche all’interno dei reservoir; oppure si inserisce la Tre in una strategia più complessa, che preveda anche l’uso di sostanze antilatenza per ripulire i reservoir.
Quando uscì l'articolo su PLoS PATHOGENS, mi parve che i passi da fare per arrivare a sperimentare la ricombinasi-Tre sugli esseri umani richiedessero una mole di lavoro tale da spostare in là di qualche anno l'inizio di un trial clinico.
Non so se Hauber e Buchholtz abbiano lavorato come dei razzi e siano già pronti, o se anche a Dresda dei ricercatori importanti siano messi così male dal punto di vista dei finanziamenti da vedere in pericolo il prosieguo delle loro ricerche.
Sta di fatto che ieri su The Local, che è un giornale tedesco che esce in inglese, è stato pubblicato un articolo sulla loro ricerca, che è stato subito ripreso anche da giornali come il New York Daily News.
Si fa riferimento al lavoro di settembre che abbiamo raccontato qui, quindi non varrebbe neppure la pena parlarne. Ma quello che ha attratto la mia attenzione è il fatto che Hauber e Buchholtz dicono che non hanno i soldi per passare alla fase clinica.
E il Professor Jürgen Rockstroh, presidente della German AIDS Society, rincara la dose, sostenendo che bisogna far saltare fuori dei fondi per poter continuare a lavorare su questo approccio così interessante:
  • "It is one of the most exciting things of all," he said. "There is a vague hope of cure, but that must first be proven."
Inoltre, Hauber specifica che la fase decisiva - quella della sperimentazione clinica - difficilmente potrà aver luogo in Germania, perché
  • "The potential is not being used," he said, claiming that pharmaceutical companies have until now shown little interest in investing in potential cures for Aids."
Quindi Hauber e Buchholtz si stanno attivando per cercare finanziamenti sia pubblici, sia privati, per poter continuare a lavorare.

Mi è venuto in mente Andrea Savarino.



nordsud
Messaggi: 497
Iscritto il: giovedì 24 maggio 2007, 17:07

Re: Endonucleasi di homing, ricombinasi-Tre: il sogno più be

Messaggio da nordsud » giovedì 19 dicembre 2013, 14:00

Dora ha scritto:
Dora ha scritto: Inoltre, Hauber specifica che la fase decisiva - quella della sperimentazione clinica - difficilmente potrà aver luogo in Germania, perché
  • "The potential is not being used," he said, claiming that pharmaceutical companies have until now shown little interest in investing in potential cures for Aids."
Quindi Hauber e Buchholtz si stanno attivando per cercare finanziamenti sia pubblici, sia privati, per poter continuare a lavorare.

Mi è venuto in mente Andrea Savarino.
Urca.. adesso chi griderà che le grosse multinazionali tengono la cura dentro il cassetto non potrà più essere bollato come demente per definizione.



Rispondi